酶制劑在玉米秸稈雙菌種固態發酵生產微生物油脂中的應用

李新社，陸步詩，金雙喜

(邵陽學院 生物與化學工程系，湖南 邵陽，422000)

能源是維系社會、經濟和環境協調發展的基礎，也是人類生存和發展的前提。面對全球社會經濟的迅速發展，人類對能源的需求日益增長，僅中國能源消耗每年就以超過 10%的速度增長[1]。開發清潔的可再生能源——生物柴油已迫在眉睫。目前，生物柴油的生產原料以植物油為主，原料成本占總生產成本的70%～85%[2]，受原料成本的影響，工業化生產程度低，經濟可行性差，因此，尋找一種廉價的原料成為生物柴油產業化的關鍵。秸稈是地球上豐富的可再生資源。據聯合國糧農組織統計，世界秸稈年產量為 20～30億t，中國每年農作物秸稈產量約7億t，占全世界秸稈總量的20%～30%[3]，其中玉米秸稈、小麥秸稈和稻稈占75%以上。目前玉米秸稈主要用于還田、氣化發電、生產食用菌[4]、造紙和生產青貯飼料[5]等，利用率不足總量的60%。一些產油微生物能夠利用各種廉價甚至廢棄的工農業下腳料如生物秸稈為原料，轉化為微生物油脂。利用微生物制備油脂具有許多優點：微生物細胞增殖快，生產周期短；微生物生長所需的原料豐富且價格便宜；能大規模生產，生產成本低；不受季節、氣候變化的限制。因此，利用微生物發酵玉米秸稈生產微生物油脂用于生物柴油的制備，不但可以使玉米秸稈得到合理的利用，同時又可以開辟一條清潔能源再生途徑解決當今面臨的能源危機。微生物發酵生產油脂的研究起步較早，早期主要集中在獲取附加值較高的功能性油脂上[6-10]。目前，研究和應用較多的油脂生產菌主要有深黃被孢霉、斯達氏酵母、圓紅冬孢酵母、黏紅酵母以及隱球酵母等[11-17]，利用皮狀絲孢酵母生產微生物油脂鮮有報道[18-19]。利用玉米秸稈發酵生產微生物油脂有報道[20-21]，但利用皮狀絲孢酵母發酵玉米秸稈生產微生物油脂未見有報道。本文作者對纖維素酶和康寧木霉預處理玉米秸稈、皮狀絲孢酵母發酵玉米秸稈預處理物積累油脂的工藝條件進行研究，以期為微生物油脂發酵生產提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 材料

玉米秸稈：采自湖南省邵陽市新邵縣農村。

菌種：康寧木霉(Trichoderma koningii，GIM3.444)、皮狀絲孢酵母(Trichosporon cutaneum，GIM2.68) 購于廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

麩皮：市場購買。

1.1.2 主要儀器

儀器主要有：722型光電比色計、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、冰箱、恒溫培養箱、離心機、真空干燥箱、顯微鏡、電子分析天平、pH計、恒溫干燥箱、超聲波細胞破碎機等。

1.1.3 試劑

試劑為：瓊脂、磷酸二氫鉀、七水合硫酸鎂、維生素B1、硫酸銨、氯化鈣、硫酸亞鐵、硫酸錳、氯化鋅、氯化鈷等，為市售化學純商品；葡萄糖、氫氧化鈉、無水亞硫酸鈉、二硝基水楊酸、酒石酸鉀、結晶酚、無水乙醚等，為市售分析純商品；纖維素酶(酶活性≥1 000 U/g)，由國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基的制備

(1) PDA 培養基的制備[22]。馬鈴薯去皮稱取200 g，切成塊煮沸 30 min，用四層紗布過濾，制成馬鈴薯汁，添加葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀3 g、七水合硫酸鎂1.5 g、維生素B1(硫胺素) 8 mg，溶解后補足水至1 L，調節 pH為 6。固體培養基的瓊脂添加量1.5%～2.0%(質量分數)。分裝后加棉塞包扎好，在121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

(2) Mandels營養鹽液的制備[23]。稱取磷酸二氫鉀2 g，硫酸銨1.4 g，七水硫酸鎂3 g，氯化鈣0.3 g，七水硫酸亞鐵5 mg，硫酸錳1.6 mg，氯化鋅1.7 mg，氯化鈷2.0 mg，溶于1 L蒸餾水中。

(3) 玉米秸稈粉固體發酵培養基制備。將玉米秸稈粉80 g、麩皮40 g和Mandels營養液100 mL裝入三角瓶中，包扎好，在121 ℃高壓蒸汽下滅菌20 min。

1.2.2 菌種活化與擴大培養

(1) 康寧木霉活化與擴大培養。PDA瓊脂培養基→分裝試管→滅菌→擺斜面→接種→培養(28 ℃培養3 d，共活化3次)→接種PDA液體培養基(三角瓶)→擴大培養(28 ℃培養4 d)→種子。

(2) 皮狀絲孢酵母的活化與擴大培養。PDA瓊脂培養基→分裝試管→滅菌→擺斜面→接種→培養(28 ℃培養3 d，共活化3次)→接種PDA液體培養基(三角瓶)→擴大培養(28 ℃培養3 d)→種子。

1.2.3 玉米秸稈預處理[24]

將玉米秸稈去葉、切斷，于72 ℃恒溫干燥箱中烘干24 h，用粉碎機粉碎，過篩(孔徑380 μm)備用。

1.2.4 還原糖含量的測定 DNS法[25]

(1) 制備DNS試劑。

① 在300 mL質量分數為4.5%的NaOH溶液中，加入1.0%二硝基水楊酸 (體積分數)溶液880 mL及酒石酸鉀鈉255 g。

② 在22 mL 10%NaOH(質量分數)溶液中加入結晶酚10 g，加水使之溶解，最后定容至100 mL。

③ 取第2步溶液69 mL加入無水亞硫酸鈉6.9 g，使之溶解。

④ 將第3步溶液注入第1步溶液中，完全溶解后，儲于棕色試劑瓶中。在室溫下，放置7～10 d以后使用。

(2) 制備1 g/L葡萄糖標準溶液。準確稱取100 mg分析純葡萄糖(預先在105 ℃下干燥至質量恒定)，用少量蒸餾水溶解后定容至 100 mL，于冰箱中保存備用。

(3) 萄糖標準曲線的繪制。表 1所示為試劑及其處理工藝。取6支洗凈烘干的25 mL有刻度比色管，編號后按表1所示加入葡萄糖溶液和蒸餾水，配制成一系列不同濃度的葡萄糖溶液。充分搖勻后，向各試管中加入2.0 mL DNS溶液，搖勻后沸水浴5 min，迅速冷卻后用蒸餾水定容至25 mL，充分混勻。在540 nm波長下，以1號試管溶液作為空白對照，調零點，用722型光電比色計測定其它各管溶液的吸光度并記錄結果。

表1 葡萄糖標準曲線繪制試劑及其處理Table 1 Reagents and its treatment of standard curve of glucose

(4) 樣品還原糖的測定。取1 mL樣品液于25 mL的比色管中，再加入2 mL DNS試劑混勻，沸水浴加熱5 min，迅速冷卻，加蒸餾水定容至25 mL，搖勻，同時以蒸餾水代替試樣進行同樣的操作進行空白對照調零點。在波長540 nm下測出吸光度，從標準曲線中查出葡萄糖質量濃度。

1.2.5 油脂含量的測定

采用索氏抽提法[26]，利用超聲波細胞破碎機使樣品中的細胞破裂，細胞內油脂釋放出來。稱取3 g樣品放入小燒杯中，將小燒杯置于72 ℃恒溫干燥箱中烘干2 h，裝入事先切成尺寸(長×寬)為8 cm×8 cm的濾紙中，包好，用長鑷子將濾紙包放入浸提管底部。將洗凈的索氏提取器小燒瓶用鉛筆在磨口處(內側)編號，于103～105 ℃下烘2 h，取出，置于干燥器內冷卻。然后用電子分析天平稱量質量，并記錄。于已稱量的小燒瓶內倒入 1/3～1/2體積的無水乙醚。連接索氏提取器各部分，在44 ℃恒溫水浴中加熱回流4 h。提取完畢，待無水乙醚完全流入小燒瓶時，取出濾紙包，再回流一次洗滌浸提管。繼續加熱，待浸提管內無水乙醚液面接近虹吸管上端而未流入小燒瓶前，倒出浸提管中溶劑。若小燒瓶中尚留溶劑，則繼續加熱蒸發，直至小燒瓶中溶劑基本蒸盡，停止加熱，取下小燒瓶，洗凈燒瓶外壁可能沾有的污漬，用電吹風將瓶中殘留的無水乙醚吹盡，再置103～105 ℃烘箱中烘30 min，取出置干燥器中冷卻至室溫，稱量。由小燒瓶增加的重量可計算出樣品的油脂含量。

1.2.6 纖維素酶和康寧木霉處理玉米秸稈的工藝條件

制備玉米秸稈粉固體發酵培養基→121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min→加入纖維素酶溶液→接種康寧木霉→置入恒溫培養箱中培養一定時間→抽濾，得濾液→定容至100 mL→測還原糖含量[27-28]。

1.2.7 皮狀絲孢酵母發酵玉米秸稈生產微生物油脂的工藝

以纖維素酶和康寧木霉發酵玉米秸稈獲得的降解物為原料，接種一定量皮狀絲孢酵母，置恒溫培養箱中培養一定時間后，檢測油脂的含量。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

配制系列濃度的葡萄糖標準溶液，用722型光電比色計進行比色測定，用空白管溶液調零點，記錄吸光度值。以葡萄糖標準溶液濃度為橫坐標，以吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，結果見圖 1。以葡萄糖為標準品制定標準曲線，y=0.628 9x-0.010 8，曲線相關系數R2=0.997 7。

2.2 纖維素酶和康寧木霉處理玉米秸稈的工藝條件

設定纖維素酶添加量、康寧木霉接種量、處理溫度、處理時間為4個變量，每因素采用三水平，進行L9(34)正交試驗，正交試驗設計見表2。通過檢測玉米秸稈處理物中還原糖含量來確定纖維素酶和康寧木霉處理玉米秸稈的最佳處理條件，正交試驗結果及數據分析見表3和表4。

表3所示為纖維素酶和康寧木霉處理玉米秸稈正交試驗結果及數據處理。由表 3可知：極差RD＞RB＞RA＞RC，主次因素順序為處理時間、康寧木霉接種量、纖維素酶添加量、處理溫度；試驗A1B2C3D3為最佳組合。

表4所示為正交試驗結果的方差分析結果。由方差分析可知：F0.05＜FB＞F0.1，F0.05＜FD＞F0.1，表明 B因子與D因子水平的改變對實驗結果有一定的影響；因子A與D以及B與D有一定的交互作用，A與B的交互作用不顯著；因子A與C的任何水平間的差異沒有達到顯著差異水平，顯著因子是B和D。因此，利用纖維素酶和康寧木霉處理玉米秸稈的最優條件是A0B2C0D3，即康寧木霉接種量為10%，處理時間為6 d，纖維素酶添加量為0.15%，0.3%和0.45%均可，處理溫度26，28和30 ℃均可。這是由于玉米秸稈是一種天然的纖維原料，主要成分是纖維素、半纖維素和木質素。纖維素結構單元是由β-1，4-糖苷鍵聯結而成的線性葡萄糖高分子聚合物，很難被降解。半纖維素主要是木糖以及少量阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖等組成的聚合物，半纖維素較易水解為單糖。木質素是以苯丙烷及其衍生物為基本單位構成的高分子芳香族化合物，起膠質的作用，將纖維素和半纖維素連接在一起，纖維素酶必須吸附到纖維素底物上才能促使纖維素降解。因此，纖維素酶對纖維素的可及性受木質素和半纖維素的影響而無法實現對纖維素的降解。伴隨著康寧木霉生長而產生的木聚糖酶對半纖維素降解，纖維素酶對纖維素的可及性增強，從而使纖維素得到有效降解。在一定范圍內，培養時間越長，降解效果越明顯。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

表2 纖維素酶和康寧木霉處理玉米秸稈正交試驗設計Table 2 Orthogonal test design of corn stalk treated with cellulase and Trichoderma koningii

表3 纖維素酶和康寧木霉處理玉米秸稈正交試驗結果及數據處理Table 3 Results of orthogonal test and data analysis of corn stalk treated with cellulase and Trichoderma koningi

表4 正交試驗結果方差分析Table 4 Valance analysis of orthogonal test

因此，在實際生產中，要控制好康寧木霉的接種量和處理時間，以促使康寧木霉良好生長，保證玉米秸稈得到充分的降解，同時，從降低成本和節約能源出發，纖維素酶添加量選擇 0.15%，處理溫度選擇26 ℃。

2.3 皮狀絲孢酵母發酵玉米秸稈生產微生物油脂的工藝條件

以最佳條件下纖維素酶和康寧木霉處理玉米秸稈獲得的降解物為原料，設定皮狀絲孢酵母接種量、培養溫度和培養時間為3個變量，每因素采用三水平，進行L9(33)正交試驗，正交試驗設計見表5，通過檢測油脂含量來確定微生物油脂生產的最佳工藝條件，正交試驗結果及數據處理見表6和7。

由表6可知：極差RC＞RA＞RB；主次因素順序為培養時間、接種量、培養溫度；試驗 A2B2C2為最佳組合。

由方差分析可知：因子A與B的任何水平間的差異沒有達到顯著差異水平，C因子水平的改變，對實驗結果有一定的影響；因子A與C的交互作用不顯著，顯著因子是C。因此，皮狀絲孢酵母發酵玉米秸稈降解物生產微生物油脂的最優工藝條件是A0B0C2，即培養時間為7 d，皮狀絲孢酵母接種量為9%，11%和13%均可，培養溫度為26，28和30 ℃均可。這是因為玉米秸稈降解物還原糖含量不高，營養物質不是特別豐富，皮狀絲孢酵母生長緩慢，因而隨著培養時間延長，油脂積累增多。

表5 皮狀絲孢酵母發酵玉米秸稈生產微生物油脂正交試驗設計Table 5 Orthogonal test design of corn stalk fermented by Trichosporon cutaneum

表6 皮狀絲孢酵母發酵玉米秸稈生產微生物油脂正交試驗結果及數據處理Table 6 Orthogonal test and data analysis of corn stalk fermented by Trichosporon cutaneum

表7 正交試驗結果方差分析Table 7 Valance analysis of orthogonal test

因此，在實際生產中，要控制好培養時間以積累更多的油脂。同時從降低成本角度出發，皮狀絲孢酵母接種量選擇9%，培養溫度選擇26 ℃。

2.4 最優條件試驗

利用纖維素酶和康寧木霉在纖維素酶添加量為0.15%，康寧木霉接種量為10%，處理溫度為26 ℃，處理時間為6 d的條件下處理玉米秸稈，并對降解物進行還原糖含量的檢測；以最佳條件下纖維素酶和康寧木霉處理玉米秸稈獲得的降解物為原料，在皮狀絲孢酵母接種量為9%，培養溫度為26 ℃，培養時間為7 d的條件下發酵，并對油脂產量進行檢測。結果見表8。

表8 最優條件試驗結果Table 8 Results of optimal test

由表8可知：在最佳條件下，利用纖維素酶和康寧木霉處理玉米秸稈，可獲得還原糖含量為4.852 g/L的玉米秸稈降解物；利用皮狀絲孢酵母發酵該玉米秸稈降解物，每100 g發酵產物中，可獲得微生物油脂3.321 g。

3 結論

(1) 纖維素酶和康寧木霉處理玉米秸稈的最優組合為A1B2C1D3，即纖維素酶添加量為0.15%，康寧木霉接種量為10%，處理溫度為26 ℃，處理時間為6 d。在最優處理條件下，可獲得還原糖含量為4.852 g/L的玉米秸稈降解物。

(2) 利用皮狀絲孢酵母發酵玉米秸稈降解物生產微生物油脂的最優組合為 A1B1C2即皮狀絲孢酵母接種量為9%，培養溫度為26 ℃，培養時間為7 d，在最優條件下每100 g發酵產物中，可獲得微生物油脂3.321 g。

[1] 王風芹, 王艷穎, 謝慧, 等. 我國生物柴油原料來源的多樣性探討[J]. 氨基酸和生物資源, 2008, 30(1): 4-9.WANG Feng-qin, WANG Yan-ying, XIE Hui, et al. Discussion on raw material diversity of biodiesel oil production in china[J].Amino Acids & Biotic Resources, 2008, 30(1): 4-9.

[2] 朱建良, 張冠杰. 國內外生物柴油研究生產現狀及發展趨勢[J]. 化工時刊, 2004, 18(1): 23-27.ZHU Jian-liang, ZHANG Guan-jie. Current situation and development trend of the research and production of biodiesel [J].Chemical Industry Times, 2004, 18(1): 23-27.

[3] 陳合, 張強. 菌酶共降解玉米秸稈的工藝研究[J]. 農業工程學報, 2008, 24(3): 270-272.CHEN He, ZHANG Qiang. Technology for co-degradation of corn stalk by microorganism and enzyme[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering, 2008, 24(3):270-272.

[4] 郝素琴, 劉艷. 我國農作物秸稈綜合利用概況[J]. 中國環境管理干部學院學報, 2007, 17(1): 65-67.HAO Su-qin, LIU Yan. General introduction to many-sided utilization of crop straw in China[J]. Journal of Environmental Management College of China, 2007, 17(1): 65-67.

[5] 張強, 秦濤, 張紅艷, 等. 玉米秸稈的綜合開發利用[J]. 玉米科學, 2006, 14(2): 168-169.ZHANG Qiang, QIN Tao, ZHANG Hong-yan, et al. The comprehensive development of the corn stalk[J]. Journal of Maize Sciences, 2006, 14(2): 168-169.

[6] 薛飛燕, 張栩, 譚天偉. 微生物油脂的研究進展及展望[J]. 生物加工過程, 2005(3): 23-27.XUE Fei-yan, ZHANG Xu, TAN Tian-wei. Research advance and prospect in microbial oils[J]. Chinese Journal of Bioprocess Engineering, 2005(3): 23-27.

[7] 薛照輝, 吳謀成. 微生物油脂進展[J]. 山西食品工業, 2002(2):10-11.XUE Zhao-hui, WU Mou-cheng. Research advance in microbial oils[J]. Shanxi Food Industry, 2002(2): 10-11.

[8] 鄭建仙, 耿立萍. 功能性食品基料-γ-亞麻酸[J]. 食品與發酵工業, 1996(1): 49-54.ZHENG Jian-xian, GENG Li-ping. A functional food material-γlinolenic acid[J]. Food and Fermentation Industries, 1996(1):49-54.

[9] 蒲海燕, 賀稚非, 劉春芬, 等. 微生物功能性油脂研究概況[J].糧食與油脂, 2003(11): 12-14.PU Hai-yan, HE Zhi-fei, LIU Chun-fen, et al. Research survey on functional fats and oils from microorganisms[J]. Journal of Cereals & Oils, 2003(11): 12-14.

[10] 羅玉萍, 楊榮英, 李思光, 等. 產棕櫚油酸酵母菌的分離和鑒定[J]. 微生物學報, 1995, 35(6): 400-403.LUO Yu-ping, YANG Rong-ying, LI Si-guang, et al. Isolation and characterization of yeast production palmitoleic acid[J]. Acta Microbiologica Sinica, 1995, 35(6): 400-403.

[11] 耿青偉, 吳開云, 吳小芹, 等. 利用深黃被孢霉發酵生產油脂的初步研究[J]. 林業科學研究, 2010, 23(3): 336-341.GENG Qing-wei, WU Kai-yun, WU Xiao-qin, et al. Preliminary study on the mortierella isabellina fermentating to produce lipid[J]. Forest Research, 2010, 23(3): 336-341.

[12] 孔祥莉, 劉波, 趙宗保, 等. 斯達氏油脂酵母利用混合糖發酵產油脂[J]. 生物加工過程, 2007, 5(2): 36-41.KONG Xiang-li, LIU Bo, ZHAO Zong-bao, et al. Microbial production of lipids by cofermentation of Glucose and xylose with Lipomyces starkeyi[J]. Chinese Journal of Bioprocess Engineering, 2007, 5(2): 36-41.

[13] 曲威, 劉波, 呂建州, 等. 高產油脂斯達氏酵母菌株的選育及搖瓶發酵條件的初步研究[J]. 遼寧師范大學學報: 自然科學版, 2006, 29(1): 88-92.QU Wei, LIU Bo, Lü Jian-zhou, et al. Study on the culture and fermentation conditions of the high lipid lipomyces starkeyi[J].Journal of Liaoning Normal University: Natural Science Edition,2006, 29(1): 88-92.

[14] 郭書賢, 王振偉, 劉歡, 等. 斯達油脂酵母發酵食品生產廢水產油脂的研究[J]. 中國食品學報, 2010, 10(4): 245-251.GUO Shu-xian, WANG Zhen-wei, LIU Huan, et al. Study on the microbial lipid production from fermentation of food products waste water by lipomyces starkeyi[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2010, 10(4):245-251.

[15] 李永紅, 劉波, 趙宗保, 等. 圓紅冬孢酵母菌發酵產油脂培養基及發酵條件的優化研究[J]. 生物工程學報, 2006, 22(4):650-655.LI Yong-hong, LIU Bo, ZHAO Zong-bao, et al. Optimized culture medium and fermentation conditions for lipid production by rhodosporidium toruloides[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2006, 22(4): 650-655.

[16] 王敏, 李市場, 劉紅霞, 等. 黏紅酵母 Rhodotorula glutinis,微生物油脂提取工藝研究[J]. 中國糧油學報, 2010, 25(6): 71-75.WANG Min, LI Shi-chang, LIU Hong-xia, et al. Study on extracting microbial oil from Rhodotorula glutinis[J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2010, 25(6): 71-75.

[17] 相光明, 趙祥穎, 劉建軍. 高產油脂隱球酵母菌發酵條件研究[J]. 糧食與油脂, 2009(3): 17-20.XIANG Guang-ming, ZHAO Xiang-ying, LIU Jian-jun. Studies on fermentation conditions for lipid production by Cryptococcus aerius[J]. Journal of Cereals & Oils, 2009(3): 17-20.

[18] 沈珺珺, 李富超, 楊慶利, 等. 皮狀絲孢酵母利用大米草水解液發酵生產微生物油脂[J]. 海洋科學, 2007, 31(8): 38-41.SHEN Jun-jun, LI Fu-chao, YANG Qing-li, et al.Fermentation of Spar tina anglica acid hydrolysate by Trichosporon cutaneumfor microbial lipid production[J]. Marine Sciences, 2007, 31(8):38-41.

[19] 李新社, 陸步詩, 曾海波. 皮狀絲孢酵母在酶法水解丟糟生產微生物油脂中的應用[J]. 釀酒科技, 2009, 186(12): 87-90,92.LI Xin-she, LU Bu-shi, ZENG Hai-bo. Application of trichosporon cutaneum in the production of microbial oil by enzymatic hydrolysis of distiller’s grains[J]. Liquor-Making Science & Technology, 2009, 186(12): 87-90, 92.

[20] 張杰, 張曉東, 李巖, 等. 多纖維素酶協同降解玉米秸稈及水解液微生物油脂發酵研究[J]. 現代化工, 2008, 28(2): 133-135.ZHANG Jie, ZHANG Xiao-dong, LI Yan, et al. Research on cellulase cooperative hydrolysis of corn stalk and microbial lipids fermentation from hydrolysates[J]. Modern Chemical Industry, 2008, 28(2): 133-135.

[21] 孫軍德, 楊冉. 產油酵母菌的篩選及其利用玉米秸稈發酵產油研究[J]. 沈陽農業大學學報, 2010, 41(3): 335-338.SUN Jun-de, YANG Ran. Screening,fermentation and identification characters of oleaginous yeasts by utilizing corn strews[J]. Journal of Shenyang Agricultural University, 2010,41(3): 335-338.

[22] 黃秀梨. 微生物學實驗指導[M]. 北京: 高等教育出版社,2006: 1-7.HUANG Xiu-li. Microbiology experimental guide[M]. Beijing:Higher Education Press, 2006: 1-7.

[23] Mandels M, Weber J. Production of cellulases[J]. Adv Chem Ser,1969, 95: 391-414.

[24] 劉雅琴, 馬俊良. 玉米秸稈粉混合菌發酵生產飼料蛋白的研究[J]. 畜牧與飼料科, 2009, 30(9): 36-38.LIU Tian-xia, LIU Ya-qin, MA Jun-liang. Study on fermentation of corn straw powder with multi-strains in feed production of proteins[J]. Animal Husbandry and Feed Science, 2009, 30(9):36-38.

[25] 王文嶺, 黃雪松. DNS法測定木糖含量最佳測定波長的選擇[J]. 食品科學, 2006, 27(4): 196-198.WANG Wen-ling, HUANG Xue-song. Identification of optimum wavelength assayed by DNS method for determination of xylose content[J]. Food Science, 2006, 27(4): 196-198.

[26] 陳鈞輝. 生物化學實驗(第四版)[M]. 北京: 科學出版社, 2008:20-22, 32-34.CHEN Jun-hui. Biochemical experiments[M]. Beijing: Science Press, 2008: 20-22, 32-34.

[27] 鄒水洋, 肖凱軍, 郭祀遠. 康寧木霉液態發酵高產纖維素酶和木聚糖酶[J]. 華南理工大學學報: 自然科學版, 2009, 37(6):69-70.ZOU Shui-yang, XIAO Kai-jun, GUO Si-yuan. Submerged fermentation of trichoderma koningii for high-yield cellulase and xylanase[J]. Journal of South China University of Technology:Natural Science Edition, 2009, 37(6): 69-70.

[28] 王菁莎, 王頡, 劉景彬. 康寧木霉固態發酵秸稈生產纖維素酶的研究[J]. 纖維素科學與技術, 2005, 13(4): 27-30.WANG Jing-sha, WANG Jie, LIU Jing-bin. Studies on solid state fermentation for cron stalk by trichoderma koningii producing cellulase[J]. Journal of Cellulose Science and Technology, 2005,13(4): 27-30.