基于支持向量機的脂肪酶耐熱序列與嗜熱序列分類研究

趙偉，許尤厚，鄭甲，王玉光，周洪波

(中南大學(xué) 資源加工與生物工程學(xué)院，湖南 長沙，410083)

脂肪酶(lipase,E.C.3.1.1.3)即三酰基甘油水解酶(triacylglycerol acylhydrolase)是一類能在油水界面上水解甘油三酯的酶，它的底物三脂酰甘油的醇部分是丙三醇，酸部分則為水不溶的十二碳以上的長鏈飽和或不飽和脂肪酸。水解反應(yīng)發(fā)生在三脂酰甘油的酯鍵上。在絲氨酸水解酶家族中，脂肪酶與酯酶、膽堿酯酶屬于進化相關(guān)的同一家族成員，這一家族涉及真核、原核和古細菌三大領(lǐng)域。由于脂肪酶來源廣泛，其蛋白序列總體的同源性不高，序列平均相似度低于30%，但它們在底物結(jié)合催化部位的氨基酸序列均含有一小段保守序列，即以絲氨酸殘基為中心，周圍有組氨酸和精氨酸/谷氨酸組成電子傳遞鏈的催化系統(tǒng)[1]。微生物脂肪酶最適pH多數(shù)在中性范圍內(nèi)，最適pH范圍與微生物種屬間的關(guān)聯(lián)并不明顯。與真菌脂肪酶的理化性質(zhì)相比，細菌脂肪酶的耐熱性較高，而嗜熱脂肪酶序列幾乎都集中于古細菌脂肪酶中[2-3]。在水溶液中，大多數(shù)脂肪酶的最適作用溫度為25～35 ℃，而在有機相中，脂肪酶作用溫度可拓寬至0～100 ℃。脂肪酶是一種目前在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛的微生物酶之一，應(yīng)用領(lǐng)域涉及食品工業(yè)、化妝品行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)、造紙工業(yè)和生物能源行業(yè)。由于工業(yè)應(yīng)用范圍的拓展，極端工業(yè)條件下(如高溫，極端酸堿)酶的穩(wěn)定性研究得到了高度重視。而獲得這些酶的途徑大多局限于極端微生物的分離培養(yǎng)，當(dāng)前，人們對Thermus，Clostridium，Bacillus，Pyrococcus，Pyrodictium，Methanopyrus，Thermococcu等嗜熱菌研究較多[4-5]，在它們中間已經(jīng)成功分離獲得了一系列具有廣闊工業(yè)應(yīng)用前景的耐高溫酶，如超嗜熱脂肪酶、pfu DNA聚合酶。但由于多數(shù)嗜熱菌的培養(yǎng)條件嚴(yán)格、生長緩慢、酶產(chǎn)量低，直接培養(yǎng)野生菌分離獲得嗜熱酶相當(dāng)困難，制約了性質(zhì)優(yōu)良工業(yè)用酶的大規(guī)模開發(fā)與應(yīng)用。隨著基因工程技術(shù)的進步，基因組重組和蛋白質(zhì)改造又為嗜熱酶的獲得提供了一條新的途徑[6]，特別在面對目前尚不可培養(yǎng)的極端微生物情況下，這種不依賴宿主生理生化特性的手段，顯示了強大的應(yīng)用潛力。本文作者從脂肪酶蛋白序列角度出發(fā)，分析了多種序列組合特征及其與蛋白性質(zhì)的聯(lián)系，從中發(fā)現(xiàn)了脂肪酶序列中與耐熱性相關(guān)的序列結(jié)構(gòu)特征。并在此基礎(chǔ)上建立了統(tǒng)計學(xué)分類篩選器，能夠有效地識別篩選具有不同耐熱性質(zhì)的微生物脂肪酶序列，為新型脂肪酶的構(gòu)建提供了有意義的信息參考，指明了可能的改造方向，提供了有效的序列識別篩分工具。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)集

本文的研究對象是微生物脂肪酶，相關(guān)的脂肪酶蛋白一級序列來源于美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(Protein Database)，三級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來源于PDB數(shù)據(jù)庫。獲取的蛋白序列數(shù)據(jù)分為普通耐熱性脂肪酶蛋白、嗜熱性脂肪酶蛋白和超級嗜熱性脂肪酶蛋白3類。所獲取的序列信息如表1所示。

1.2 氨基酸殘基出現(xiàn)頻率的計算

序列中 20種氨基酸殘基的出現(xiàn)頻率計算公式[7]如下：

式中：i代表 20種氨基酸殘基序號；ni為相對應(yīng)殘基出現(xiàn)的次數(shù)；N為20種殘基出現(xiàn)的總數(shù)。

1.3 二肽片段出現(xiàn)頻率的計算

序列中400種二肽片段的出現(xiàn)頻率計算公式[8-10]如下：

式中：i和j分別代表在A位點和A+1位點的20種氨基酸殘基中的序號；Nij為i殘基后緊接著出現(xiàn)j殘基的次數(shù)；L-1為在長度為L的序列中可能會出現(xiàn)的二肽片段總數(shù)。

1.4 三肽片段出現(xiàn)頻率的計算

序列中8 000種三肽片段的出現(xiàn)頻率計算公式如下：

式中：i，j與k分別代表在A位點，A+1位點和A+2位點的20種氨基酸殘基中的序號；Nijk是i殘基后緊接著出現(xiàn)j殘基和k殘基的次數(shù)；L-2則是在長度為L的序列中可能會出現(xiàn)的三肽片段總數(shù)。

1.5 非相鄰二元組合出現(xiàn)頻率的計算

序列中 400×Interval(IN)種二肽片段的出現(xiàn)頻率計算公式如下：

式中：i和j分別代表在A位點和A+IN位點的20種氨基酸殘基中的序號；Nijint是i殘基后插入IN個殘基再出現(xiàn)j殘基的次數(shù)；400×IN則是可能出現(xiàn)的非相鄰二元組合總數(shù)。

1.6 模型建立與篩分器構(gòu)建

研究所用支持向量機軟件是 libSVM，可通過http://www.csie.ntu.edu.tw/～cjlin/libsvm/免 費 獲 取 使用[11]。測試過程中進行了 20輪交互驗證(cross-validation)，并分別計算了分類準(zhǔn)確度、靈敏度和特異性3個參數(shù)。此3個參數(shù)的計算公式如下：

表1 微生物脂肪酶序列信息Table 1 Accession number of microbial lipase sequences

式中：Se為靈敏度；Sp為特異性；Ac為準(zhǔn)確度；TP為正確判斷嗜熱脂肪酶序列的個數(shù)；TN為將耐熱脂肪酶序列錯誤判斷為嗜熱脂肪酶序列的個數(shù)；FP為正確判斷耐熱脂肪酶序列的個數(shù)；FN為將嗜熱脂肪酶序列錯誤判斷為耐熱脂肪酶序列的個數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸殘基個數(shù)與耐熱性的關(guān)系

結(jié)果顯示，按照耐熱性質(zhì)分組統(tǒng)計，耐熱脂肪酶、嗜熱脂肪酶和超級嗜熱脂肪酶的序列長度分布各有所不同。耐熱脂肪酶在序列長度大于400殘基區(qū)段的比例最大，嗜熱脂肪酶在序列長度為300至400殘基區(qū)段的比例最大，而超級嗜熱脂肪酶則在200至400的區(qū)段平衡分布，如圖1所示。統(tǒng)計結(jié)果顯示從耐熱酶到嗜熱酶，明顯的序列長度減小，而比較嗜熱酶和超級嗜熱酶的序列長度情況卻不存在顯著差異。但序列長度數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差顯示3種不同耐熱性質(zhì)脂肪酶序列的長短分散度不同，嗜熱脂肪酶序列長度最集中，而耐熱脂肪酶序列長度最分散。

圖1 脂肪酶序列長度分布Fig.1 Sequence length distribution and composition statistical analysis of lipases

為了消除天然背景中不同氨基酸使用頻率差異帶來的影響，需要建立天然蛋白序列氨基酸殘基使用頻率本底庫。從Swiss-port數(shù)據(jù)庫中統(tǒng)計獲得了天然狀態(tài)下原核生物蛋白質(zhì)氨基酸殘基的出現(xiàn)頻數(shù)(圖2)，作為背景參考。

統(tǒng)計分析顯示存在著和耐熱性正相關(guān)或負相關(guān)的氨基酸。其中，對于酸性和堿性氨基酸，組氨酸、精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的含量都呈現(xiàn)出與蛋白耐熱性正相關(guān)的關(guān)系；半胱氨酸也存在著正相關(guān)的聯(lián)系。絲氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的含量也與耐熱性正相關(guān)。而呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系的氨基酸主要有疏水性氨基酸丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及不帶電荷的極性氨基酸天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸和甘氨酸。在這些氨基酸殘基中天冬酰胺殘基的出現(xiàn)頻率顯得較為特殊，一方面，耐熱蛋白和嗜熱蛋白序列中天冬酰胺出現(xiàn)頻率明顯高于Swiss-Port數(shù)據(jù)庫中可獲得的所有蛋白序列平均天冬酰胺殘基出現(xiàn)頻率，表明天冬酰胺殘基具有一定的耐熱性質(zhì)偏愛；另一方面，天冬酰胺殘基出現(xiàn)頻率在嗜熱蛋白與耐熱蛋白中的差異趨勢不統(tǒng)一，耐熱脂肪酶和嗜熱脂肪酶都有含天冬酰胺殘基較多的序列，天冬酰胺殘基對脂肪酶耐熱性提高的作用又顯得不明確。其實，這樣的結(jié)果在Yamamoto等[12-13]的研究中也曾有報道，Yamamoto等[12]發(fā)現(xiàn)在磷酸化酶序列中用天冬酰胺替換天冬氨酸，可使得該酶的熱穩(wěn)定溫度由 60.0 ℃提升至67.5 ℃；而Rollence等[14]則發(fā)現(xiàn)某一嗜熱蛋白與其常溫對應(yīng)蛋白相比，僅置換了1個氨基酸殘基，即天冬酰胺殘基被異亮氨酸替換，就大幅度提高了該蛋白的熱穩(wěn)定性。Rollence等[14]認(rèn)為是天冬酰胺殘基在高溫下易于發(fā)生脫氨基反應(yīng)，使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)失穩(wěn)。

圖2 Swiss-Port數(shù)據(jù)庫中原核生物蛋白質(zhì)20種氨基酸分布頻率Fig.2 Distribution of prokaryotic amino acid composition in Swiss-port database

2.2 寡肽片段組成與耐熱性的關(guān)系

嗜熱蛋白序列中共有 19個與其蛋白性質(zhì)可能存在正相關(guān)性的二肽片段，有6個與其蛋白性質(zhì)可能存在負相關(guān)性的二肽片段；耐熱蛋白序列中共有31個與其蛋白性質(zhì)可能存在正相關(guān)性的二肽片段，有16個與其蛋白性質(zhì)可能存在負相關(guān)性的二肽片段。

呈現(xiàn)序列特征與蛋白耐熱性特征正相關(guān)的二肽片段有 KC，EE，KE，RE，VE，YI，EK，VK，EV，YV，EY，KY，VY和 YY；而呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系的二肽片段有QC，QH，QN，HQ，MQ，NQ，QQ，TQ，QS和QT(表2)。從二肽片段組成情況可以推斷出賴氨酸、谷氨酸、酪氨酸、纈氨酸和精氨酸含量與蛋白質(zhì)耐熱性呈正相關(guān)關(guān)系，而谷氨酰胺、組氨酸、天冬酰胺、蛋氨酸、蘇氨酸的含量與蛋白質(zhì)耐熱性呈負相關(guān)關(guān)系，這一結(jié)論和氨基酸組成分析結(jié)果一致。Chapelle等[15]認(rèn)為Cation-π效應(yīng)可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)，其主要原因是KY與YK的作用，同時研究發(fā)現(xiàn)KY，EI和VY在耐熱蛋白質(zhì)中具有顯著的殘基內(nèi)相互作用。這部分結(jié)果與本研究結(jié)果相符合。

呈現(xiàn)正相關(guān)的二肽片段組合體現(xiàn)出帶電氨基酸殘基組合的特點，同時芳香族氨基酸也占有一定優(yōu)勢；呈現(xiàn)負相關(guān)的二肽片段組合則全部為谷氨酰胺與其他酰胺殘基或組氨酸殘基的組合，從總體上看，呈現(xiàn)出酰胺殘基與耐熱性負相關(guān)強烈相關(guān)，這點與酰胺殘基高溫下易脫氨而變得不穩(wěn)定密切相關(guān)。

表2 脂肪酶序列中與蛋白耐熱性顯著相關(guān)的二肽片段Table 2 Positive and negative correlative characteristic dipeptides of thermostable character from mesophilic to thermophilic proteins

2.3 三肽片段組成與耐熱性的關(guān)系

為了進一步挖掘蛋白序列編碼信息與耐熱特性之間的關(guān)聯(lián)性，在二肽片段組成分析的基礎(chǔ)上進一步開展了三肽片段組成研究。三肽組成由于片段長度的增加而導(dǎo)致了位點殘基確定性的增加，進而使得序列編碼信息的含量增加。在蛋白質(zhì)性質(zhì)功能由編碼復(fù)雜度和編碼量共同決定的假設(shè)前提下，三肽組成研究將能夠比二肽組成研究更精確的揭示系列特征和性質(zhì)特征之間的關(guān)聯(lián)。與二肽片段分析類似，分析計算了標(biāo)準(zhǔn)化的8 000個三肽片段組合頻率，顯著性三肽片段和耐熱相關(guān)特征三肽片段。這里僅列出了與耐熱相關(guān)的統(tǒng)計顯著特征三肽片段，如表3所示。

與蛋白耐熱性正相關(guān)的三肽片段主要以正相關(guān)二肽片段的組成殘基為基本組合單元，但在最顯著的片段中新出現(xiàn)了脯氨酸(P)殘基、半胱氨酸(C)殘基，含有脯氨酸殘基或半胱氨酸殘基的片段占正相關(guān)片段18.5%，且這 2種殘基總是同時出現(xiàn)在相同組合中，除此以外，還有精氨酸(R)殘基也是首次出現(xiàn)在顯著性片段中，含有精氨酸的片段占正相關(guān)片段11.1%。結(jié)果表明除了K，E，V和Y的殘基組合外，C-P組合在三肽片段中也是一種與蛋白耐熱性正相關(guān)的典型組合形式。

表3 脂肪酶序列中與蛋白耐熱性顯著相關(guān)的三肽片段Table 3 Most significant positive correlated and negative correlated tripeptides in thermophilic proteins

而與蛋白耐熱性呈負相關(guān)的高顯著性三肽片段依舊全部都是谷氨酰胺(Q)殘基組合，但與二肽片段有所不同的是：Q片段三肽組合的方向性明顯增強，同時與谷氨酰胺殘基配對的殘基也發(fā)生了微小變化，例如蘇氨酸(T)殘基不再出現(xiàn)于三肽片段中，而天冬氨酸(D)殘基則出現(xiàn)在三肽片段中，含有天冬氨酸殘基的三肽片段占最顯著負相關(guān)三肽片段 22.2%。

表3的結(jié)果顯示了序列編碼的偏好性對蛋白序列性質(zhì)的影響。在高維片段組合中，偏愛性即代表了序列編碼隨機性的降低和信息含量的增加，顯示了三肽片段組成分析對蛋白序列信息提取的有效性。蛋白質(zhì)序列相鄰殘基組合的研究結(jié)果顯示：無論是二肽片段組合還是三肽片段組合，帶電性殘基組合為耐熱性序列優(yōu)勢特征，而谷氨酰胺(Q) 殘基的存在是蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性減弱的最主要原因。但其也顯示出帶電氨基酸殘基在一級序列中所處位置對序列耐熱性的重要影響，如二肽片段EV和VE(表2)具有不同不同程度的正相關(guān)性，K 在三肽片段 KCP，KYV，KVY等中顯示了顯著的熱穩(wěn)定正相關(guān)性，而在QHK和DKQ中則顯示了顯著的熱穩(wěn)定負相關(guān)性(表3)。

2.4 非相鄰二元組合與耐熱性的關(guān)系

寡肽片段揭示了相鄰氨基酸殘基片段組合的偏愛性，顯示了序列中局部區(qū)域的特性。寡肽片段的偏愛增加了序列編碼信息量，增加了蛋白質(zhì)性質(zhì)、功能擴展的潛能。但若將蛋白質(zhì)一級序列簡化為20個字符的編碼字符串，則容易看出：對于增加字符串信息載量[16-17]，最容易的方式是確定位點中字符類型或縮小字符變化范圍，這樣的形式能夠以相鄰或相間2種情況存在。既然寡肽片段所代表的相鄰情況已顯示序列編碼偏愛性與性質(zhì)存在關(guān)聯(lián)關(guān)系，則可推斷：相間模式或者相鄰-相間混合模式也存在著類似關(guān)系[18-19]。以下即是從此推斷研究相間情況的結(jié)果。由于相間情況變化復(fù)雜而導(dǎo)致計算量大幅增加，如進行一次二肽片段(相鄰)組合分析的計算量為20(即 20種氨基酸殘基個數(shù))×20(即 20種氨基酸殘基個數(shù))×N(即樣本中序列數(shù)目)，進行1次二元模式(相間)組合分析所需的計算量為20(即20種氨基酸殘基個數(shù))×20(即20種氨基酸殘基個數(shù))×Step(即相間步長，本研究中步長變化范圍為1～100個氨基酸殘基)×N(即樣本中序列數(shù)目，本研究中N=20 000)。可見：進行一次二元模式分析在同樣計算能力下所需的時間是進行一次二肽片段組合分析的Step(本研究中即為100)倍。所以，在目前可以獲得的計算能力下，只進行了二元模式組成的分析。

為了提取顯著性高的序列特征，減少后續(xù)分類工作的難度，在分析了氨基酸組成、二肽片段、三肽片段和二元模式之間的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)它們之間存在互相關(guān)聯(lián)或者部分包含的關(guān)系。因此，為提取序列分類特征篩選了8個差異性最顯著的二元模式，分別為PR14，RY32，YR47，LE53，LE64，PP64，RP70 和 PP101。以上8個差異性最顯著的二元模式組成在嗜熱蛋白和耐熱蛋白序列(各10組，每組20 000條，共200 000條)中的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示 8種模式在嗜熱蛋白中比在常溫蛋白中出現(xiàn)頻率要高，且分布更趨均勻(表 4)。非相鄰的二元模式組合不僅僅揭示了氨基酸殘基在一級序列中位置對蛋白性質(zhì)影響的重要性，還反映出殘基間間隔殘基數(shù)目對蛋白性質(zhì)影響的重要性，表明蛋白質(zhì)一級序列中的殘基是一種包含了長度和方向的矢量信息點，而非以往認(rèn)為的標(biāo)量點。

非相鄰二元組合表示方法為：氨基酸殘基符號×氨基酸殘基符號×Step(相間步長，本研究中步長變化范圍為1～100個氨基酸殘基)，如PR14代表序列中由Pro與Arg 相間14個殘基所形成的二元組合。

表4 脂肪酶序列中8個與蛋白耐熱性顯著相關(guān)的非相鄰二元組合Table 4 Analysis of eight most significant di-residue patterns in thermophilic and mesophilic protein sequences

二元組合在序列中平均出現(xiàn)次數(shù)的差異的計算方法為

式中：D為差異值；Ntherm為特定二元組合在每條耐熱序列中平均出現(xiàn)次數(shù)；Nhype為特定二元組合在每條嗜熱序列中平均出現(xiàn)次數(shù)。

2.5 非相鄰二元組合與耐熱性的關(guān)系

在單因子分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)特征對序列分類正確分辨率的貢獻不同和特征向量所反映序列信息的差異，進一步研究單因子序列特征組合對蛋白耐熱性的分類正確率的影響，采用三肽組成(TPC)和二元模式(DRPC)組合的模式。實驗的結(jié)果顯示，三肽組成和二元模式組合模式在 20組獨立隨機測試中都獲得了很高的分辨正確率(甄別閾為0.5)，足以滿足后續(xù)研究構(gòu)建性質(zhì)篩分器的需求，結(jié)果如表5所示。

表5 基于三肽組成(TPC)和二元模式(DRPC)組合特征對脂肪酶耐熱和嗜熱序列分類結(jié)果Table 5 Results of classification using TPC combined DRPC

3 結(jié)論

(1) 嗜熱脂肪酶序列中亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、Trp和Tyr殘基的增加與蛋白耐熱性提高正相關(guān)。

(2) 二肽片段KC，EE，KE，RE，VE，YI，EK，VK，EV，YV，EY，KY，VY和YY的含量在嗜熱脂肪酶序列中顯著比耐熱脂肪酶序列的高。

(3) CYP，KCP，VEE，EEY，EVY，KVY等三肽片段的含量與脂肪酶耐熱性質(zhì)密切相關(guān)。

(4) 嗜熱脂肪酶序列和耐熱脂肪酶序列中PR14，RY32，YR47，LE53，LE64，PP64，RP70 和 PP101等非相鄰二元組合的偏愛性。

(5) 利用這些組合特征，發(fā)展了基于支持向量機的脂肪酶耐熱性高效篩分方法，其應(yīng)用于真實數(shù)據(jù)集的分類準(zhǔn)確率達到了98.41%。

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