益智仁揮發(fā)油抗帕金森模型小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡的作用研究

黃 凌，朱 毅，鄺少軼（1.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理教研室，海口市 571101；.海南省藥品檢驗(yàn)所，海口市57016）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一種中老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，主要病理改變是中腦黑質(zhì)致密部（SNc）多巴胺（DA）能神經(jīng)元選擇性地死亡、缺失，致紋狀體DA不足，從而導(dǎo)致基底節(jié)神經(jīng)調(diào)節(jié)功能的紊亂，在臨床上表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)不穩(wěn)等。目前PD的病因尚未清楚，一般認(rèn)為是由遺傳、年齡、環(huán)境、氧化應(yīng)激免疫異常、興奮性氨基酸毒性、線粒體功能障礙等多種因素所致的中腦SNc DA能神經(jīng)元死亡，而細(xì)胞凋亡是這種細(xì)胞死亡的主要方式。因此，對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)和抗細(xì)胞凋亡的治療已成為PD治療的主要思路之一。

近年來(lái)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中證實(shí)益智仁具有良好的腦保護(hù)作用，可用于老年性癡呆及其他智能障礙類疾病的治療，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有抗氧化、抗衰老、減輕興奮性毒性和抗凋亡作用[1，2]。筆者前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明[3，4]，益智仁的重要化學(xué)成分揮發(fā)油具有對(duì)抗PD模型小鼠行為學(xué)改變，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高PD模型小鼠抗活性氧的防御能力，并且在減少凋亡起始因子表達(dá)的同時(shí)促進(jìn)抗凋亡因子的表達(dá)的作用，本研究旨在進(jìn)一步探討益智仁揮發(fā)油是否具有減輕PD模型小鼠腦內(nèi)組織和神經(jīng)元的受損程度，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，為尋求具有防治PD作用的天然藥物提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器

烤箱（佛山市高明溫雅精密烤箱有限公司）；BX41型顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 試藥

干燥益智仁購(gòu)于海南省萬(wàn)寧縣益智（GAP）種植與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)示范基地，經(jīng)海南省藥品檢驗(yàn)所中藥室鑒定為真品。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP，美國(guó)Sigma公司）；司來(lái)吉蘭（南京思科藥業(yè)有限公司，批號(hào)：100911）；甲苯氨蘭染色劑、兔抗小鼠酪氨酸羥化酶（TH）、半胱氨酸酶-3（Caspase-3）多克隆抗體、鏈霉親和素-生物素-酶復(fù)合物（SABC）免疫組化試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)于武漢博士德生物工程研究所。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL小鼠，10～12周齡，♂，體重24～30 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2003-0002）。所購(gòu)動(dòng)物普通飲食喂養(yǎng)5 d后開始實(shí)驗(yàn)，控制室溫為（22±2）℃，濕度為（55±15）%，保持12 h明暗循環(huán)，標(biāo)準(zhǔn)飲食。

2 方法

2.1 藥物的提取

按2010年版《中國(guó)藥典》[5]中水蒸氣蒸餾法提取益智仁揮發(fā)油，將干燥益智仁粉碎為益智仁粉末（80目過(guò)篩），m（益智仁）∶m（蒸餾水）＝1∶8，浸泡6 h，蒸餾6～8 h，得益智仁揮發(fā)油，提取率為0.4%。氣相色譜分析的結(jié)果顯示，用于本研究的益智仁揮發(fā)油質(zhì)量穩(wěn)定、可控。給藥前，以吐溫80作為乳化劑（占乳劑體積0.5%），將益智仁揮發(fā)油與蒸餾水按比例制成對(duì)應(yīng)濃度乳劑，用前搖勻。

2.2 分組與給藥

實(shí)驗(yàn)分為6組，即正常對(duì)照、模型、司來(lái)吉蘭和益智仁揮發(fā)油高、中、低劑量（2.5、0.833、0.278m L·kg-1）組。正常對(duì)照組：ig生理鹽水0.1m L·10 g-1，每天1次，連續(xù)12 d。模型組：ig生理鹽水0.1 m L·10 g-1，每天1次，連續(xù)12 d；自第6天起ip MPTP30mg·kg-1，每天1次，連續(xù)7 d。司來(lái)吉蘭組：ig 司來(lái)吉蘭10mg·kg-1，每天1次，連續(xù)10 d；自第4天起ig司來(lái)吉蘭0.5 h后ip MPTP30mg·kg-1，連續(xù)7 d。益智仁揮發(fā)油高、中、低劑量組：分別ig益智仁揮發(fā)油乳劑2.5、0.833、0.278m L·kg-1，每天1次，連續(xù)12 d；自給予益智仁揮發(fā)油第6天起ip MPTP30 mg·kg-1，每天1次，連續(xù)7 d。

2.3 尼氏染色法觀察尼氏小體表達(dá)

切片脫蠟后浸入1%甲苯胺藍(lán)水溶液中50～60℃溫箱內(nèi)浸染20～40m in，蒸餾水洗后95%乙醇迅速分化，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)呈藍(lán)色塊染。

2.4 SABC免疫組化染色法觀察TH表達(dá)

流程按SABC試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，組織經(jīng)常規(guī)4%多聚甲醛固定2周后，再換入含20%蔗糖的0.01mmol·L-1PBS中，待腦組織下沉后，根據(jù)鼠腦部圖譜SNc位置作連續(xù)冠狀石蠟切片。采用SABC法進(jìn)行免疫組化染色。腦片脫蠟至水，枸櫞酸鹽緩沖液中熱修復(fù)，用 0.01mmol·L-1PBS（pH 7.4）振蕩漂洗3次，3%H2O2滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次后滴加BSA封閉液20min，加入兔抗小鼠TH、Caspase-3多克隆抗體（以PBS稀釋100倍）4℃孵育過(guò)夜；生物素標(biāo)記的二抗免疫球蛋白G（IgG）血清室溫孵育20m in，PBS洗3次；與SABC試液室溫下孵育20m in，PBS洗4次；用新配的DAB顯色，顯微鏡下觀察適時(shí)用蒸餾水終止反應(yīng)，蘇木素輕度復(fù)染。貼片，晾干，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察并攝片。每組每只動(dòng)物選一張腳間核平面切片，每張隨機(jī)選一側(cè)SNc，每張切片選取部位盡量一致，以顯微鏡l0倍物鏡采集圖像，每張免疫組化切片隨機(jī)選取SNc400倍視野3個(gè)，計(jì)數(shù)TH陽(yáng)性細(xì)胞，拍片。陽(yáng)性細(xì)胞胞漿胞膜著棕色。

2.5 TUNEL染色法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡

按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，組織經(jīng)常規(guī)4%多聚甲醛固定2周后，再換入含20%蔗糖的0.01mmol·L-1PBS中，待腦組織下沉后，根據(jù)鼠腦部圖譜SNc位置作連續(xù)冠狀石蠟切片。切片常規(guī)脫蠟入水，新鮮配制3%H2O2，室溫處理10m in，標(biāo)本片加0.01mol·L-1Tris緩沖鹽溶液（TBS）1∶200新鮮稀釋Proteinase K 37 ℃消化1～15min，0.01mol·L-1TBS洗3次，每次2m in。標(biāo)本片加標(biāo)記緩沖液（Labeling Buffer）20μL/片，以保持切片濕潤(rùn)。按每張切片取TdT和DIG-d-UTP各1μL，加入18μL標(biāo)記緩沖液中，混勻。甩去切片上多余液體后加標(biāo)記液，20μL/片，37℃標(biāo)記2min后加封閉液50μL/片，室溫30min，甩掉封閉液，不洗。用抗體稀釋液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體（取1m L抗體稀釋液加生物素化抗地高辛抗體10μL），混勻后50μL/片加至標(biāo)本片上，37℃反應(yīng)30min，用抗體稀釋液1∶100稀釋SABC（取1m L抗體稀釋液加SABC 10μL），混勻后50μL/片加至切片，37℃反應(yīng)30m in，用新配的DAB顯色，顯微鏡下觀察適時(shí)用蒸餾水終止反應(yīng)，蘇木素輕度復(fù)染。貼片，晾干，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察并攝片。

2.6 測(cè)定分析

根據(jù)圖譜對(duì)中腦SNc的尼氏小體、TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和凋亡小體進(jìn)行計(jì)數(shù)，每一例在光鏡400倍條件下重復(fù)觀察3張切片，每張切片取不同視野3個(gè)計(jì)數(shù)后取平均數(shù)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 尼氏染色檢測(cè)結(jié)果

尼氏染色神經(jīng)元細(xì)胞呈細(xì)胞核淡染，核仁明顯，胞漿呈藍(lán)色；尼氏小體為深藍(lán)色顆粒狀存在于胞漿中。與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠DA神經(jīng)元的光密度及尼氏小體數(shù)量明顯降低（P＜0.01）；司來(lái)吉蘭能顯著增加單個(gè)視野下PD小鼠腦內(nèi)細(xì)胞尼氏小體的光密度（P＜0.01）；與模型組比較，益智仁揮發(fā)油高、中劑量組的尼氏小體的光密度顯著增加（P＜0.01或P＜0.05）。結(jié)果表明，益智仁揮發(fā)油可增加PD模型小鼠SNc神經(jīng)元內(nèi)尼氏小體的含量，提示益智仁揮發(fā)油具有保護(hù)PD模型小鼠SNc神經(jīng)元的作用。尼氏小體陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果見表1、圖1。

表1 尼氏小體陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果（±s，400×）Tab 1 Resultsof Nissl’s cytoryctesexpression（±s，400×）

表1 尼氏小體陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果（±s，400×）Tab 1 Resultsof Nissl’s cytoryctesexpression（±s，400×）

與正常對(duì)照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對(duì)照組模型組益智仁揮發(fā)油高劑量組益智仁揮發(fā)油中劑量組益智仁揮發(fā)油低劑量組司來(lái)吉蘭組尼氏小體93.5±5.806 49.14±6.20＊71.86±7.10##61.75±9.036#52.57±5.68 80.34±5.17##n 8 8 8 8 8 8

圖1 尼氏小體陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果（甲苯胺藍(lán)，200×）A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.益智仁揮發(fā)油高劑量組；D.益智仁揮發(fā)油中劑量組；E.益智仁揮發(fā)油低劑量組；F.司來(lái)吉蘭組Fig 1 Results of Nissl’s cytoryctes expression（toluidine blue，200×）A.normal control group；B.model group；C.Alpinnia oxyphylla high dose group；D.A.oxyphylla medium dose group；E.A.oxyphylla low dose gro-up；F.selegilinegroup

3.2 SABC免疫組化檢測(cè)結(jié)果

TH免疫陽(yáng)性細(xì)胞為棕色，呈橢圓形或錐形，位于胞漿及胞膜，模型組小鼠SNc的TH免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較正常對(duì)照組的單個(gè)視野下TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.01），分布稀疏；而益智仁揮發(fā)油高、中、低劑量組的TH免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較模型組顯著增加（P＜0.01）。結(jié)果表明，益智仁揮發(fā)油具有對(duì)抗MPTP所引起的TH減少的作用。TH免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果見表2、圖2。

3.3 TUNEL染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡結(jié)果

SNc神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是PD的重要指征之一，正常對(duì)照組小鼠神經(jīng)元TUNEL陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞呈棕色，陽(yáng)性偶見，而模型組小鼠紋狀體內(nèi)TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著多于正常對(duì)照組，而益智仁揮發(fā)油高、中、低劑量組細(xì)胞TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著低于模型組（P＜0.01或P＜0.05）。結(jié)果表明，益智仁揮發(fā)油使PD模型小鼠DA神經(jīng)元凋亡數(shù)量顯著降低，具有減輕MPTP對(duì)DA神經(jīng)元的損傷作用。TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果見表3、圖3。

表2 TH陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果（±s，400×）Fig 2 Resultsof TH expressio（n±s，400×）

表2 TH陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果（±s，400×）Fig 2 Resultsof TH expressio（n±s，400×）

與正常對(duì)照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

模型組正常對(duì)照組模型組益智仁揮發(fā)油高劑量組益智仁揮發(fā)油中劑量組益智仁揮發(fā)油低劑量組司來(lái)吉蘭組陽(yáng)性細(xì)胞51.5±7.15 10.29±2.69＊31.57±6.13##23.75±4.37#13.57±3.36#40.43±5.07#n 8 8 8 8 8 8

圖2 TH陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果（DAB，400×）A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.益智仁揮發(fā)油高劑量組；D.益智仁揮發(fā)油中劑量組；E.益智仁揮發(fā)油低劑量組；F.司來(lái)吉蘭組Fig 2 Resultsof TH expression（DAB，400×）A.normal control group；B.model group；C.A.oxyphylla high dose group；D.A.oxyphylla medium dose group；E.A.oxyphylla low dose group；F.selegilinegroup

表3 TUNEL染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡結(jié)果（±s，400×）Tab 3 Results of the apoptosis of substantia nigra neurons of TUNEL（±s，400×）

表3 TUNEL染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡結(jié)果（±s，400×）Tab 3 Results of the apoptosis of substantia nigra neurons of TUNEL（±s，400×）

模型組陽(yáng)性細(xì)胞n正常對(duì)照組模型組益智仁揮發(fā)油高劑量組益智仁揮發(fā)油中劑量組益智仁揮發(fā)油低劑量組司來(lái)吉蘭組12.14±2.85 36.43±4.79＊21.00±3.70##28.38±6.30##30.71±3.49#17.67±3.17##8 8 8 8 8 8

4 討論

PD是一種老年神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，病因和發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，主要改變包括選擇性SNc-紋狀體DA能神經(jīng)元的變性和喪失，紋狀體DA含量顯著減少，膽堿遞質(zhì)釋放過(guò)多而引起神經(jīng)退行性病變，且伴有5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）釋放量的改變和DA功能失調(diào)[6]。DA是一種抑制性神經(jīng)介質(zhì)，當(dāng)DA含量降至正常的30%，就可能有PD的癥狀出現(xiàn)。給予MPTP后，模型組小鼠DA含量顯著降低，小鼠表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)減少、肢體僵硬、步態(tài)不穩(wěn)、反應(yīng)遲緩等[3，7]，表明運(yùn)用MPTP可成功復(fù)制C57BL小鼠PD模型。

圖3 TUNEL染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡結(jié)果（DAB，400×）Fig 3 Results of the apoptosis of substantia nigra neurons of TUNEL（DAB，400×）A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.益智仁揮發(fā)油高劑量組；D.益智仁揮發(fā)油中劑量組；E.益智仁揮發(fā)油低劑量組；F.司來(lái)吉蘭組A.normal control group；B.model group；C.A.oxyphylla high dose group；D.A.oxyphylla medium dose group；E.A.oxyphylla low dose group；F.selegilinegroup

尼氏小體為神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的噬堿性顆粒，分布于神經(jīng)原除軸突和軸丘以外的胞漿中，其主要作用是合成蛋白質(zhì)，尼氏小體常作為判斷神經(jīng)細(xì)胞存活的標(biāo)志，其變化基本能反映SNc DA神經(jīng)元的情況。本研究中模型組小鼠尼氏小體的表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組，而給予益智仁揮發(fā)油可以減少由MPTP造成的尼氏小體表達(dá)降低的情況，提示益智仁揮發(fā)油具有保護(hù)DA神經(jīng)元的作用[8]。

TH是DA合成的限速酶，在DA能神經(jīng)元中含量豐富，SNc內(nèi)TH的一場(chǎng)改變無(wú)論作為原發(fā)還是繼發(fā)改變，其含量與功能不足都是導(dǎo)致PD一系列臨床癥狀的重要環(huán)節(jié)，其數(shù)量的多寡反映了神經(jīng)元凋亡的嚴(yán)重程度。MPTP的毒性代謝產(chǎn)物MPP+可以抑制THmRNA的表達(dá)，可造成小鼠DA能神經(jīng)元功能的降低，誘發(fā)PD樣的行為表現(xiàn)[9]；本研究中，模型組小鼠TH表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組，而給予益智仁揮發(fā)油可以減輕MPTP的神經(jīng)毒性作用，減少由MPTP造成的TH表達(dá)降低的情況，從而起到對(duì)抗MPTP的神經(jīng)毒性，保護(hù)DA能神經(jīng)元的作用。

以往的許多研究中獲得了PD過(guò)程中細(xì)胞凋亡的證據(jù)，如Kingsbury AE等[10]用TUNEL法發(fā)現(xiàn)16例病理確認(rèn)為PD的患者中腦SNc內(nèi)可見尼氏小體，提示細(xì)胞凋亡在DA能神經(jīng)元損傷過(guò)程中可能占有重要地位。本研究中應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)觀察益智仁揮發(fā)油對(duì)腦內(nèi)DA能神經(jīng)元的抗凋亡作用，并從凋亡調(diào)控基因的角度探討其保護(hù)機(jī)制，結(jié)果表明，模型組細(xì)胞凋亡程度明顯高于正常對(duì)照祖，細(xì)胞凋亡是MPTP導(dǎo)致SNc DA能神經(jīng)元損害的主要作用方式之一，而益智仁揮發(fā)油高、中、低劑量組細(xì)胞凋亡程度顯著低于模型組，而高劑量組抑制凋亡的作用優(yōu)于中、低劑量組，提示益智仁揮發(fā)油具有抑制MPTP所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用，并且益智仁揮發(fā)油對(duì)凋亡的對(duì)抗作用可能存在一定量效關(guān)系。

以上結(jié)果表明，益智仁揮發(fā)油能通過(guò)對(duì)抗MPTP所致的小鼠行為學(xué)改變，增強(qiáng)DA合成限速酶TH的表達(dá)，減少凋亡因子Caspase-3的表達(dá)，從而起到抑制細(xì)胞凋亡抗PD的作用。但益智仁揮發(fā)油在臨床應(yīng)用時(shí)是否能夠有效控制和改善PD的病程發(fā)展、患者的癥狀，真正成為PD的治療藥物，仍然需要更深入的研究。

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