γ干擾素和轉化生長因子β水平與支氣管結核治療效果的關聯性研究

梁莉 樂軍 劉麗蓉 沙巍 方勇 蔣瑞華 唐神結 肖和平

支氣管結核（endobronchial tuberculosis，EBTB）是指發生在氣管、支氣管黏膜和黏膜下層的結核病。肺結核患者中，EBTB發病率為10%至38%［1］。而活動性菌陽肺結核患者中大約40%～80%伴有EBTB。支氣管結核的單純全身化療療效欠佳；EBTB所致支氣管狹窄是良性氣道狹窄最常見的原因，而且臨床容易誤診為支氣管哮喘或肺癌［2］。

研究表明大多數結核分枝桿菌感染者未發生任何臨床疾病，因此宿主抗結核分枝桿菌反應和結核分枝桿菌的毒力對疾病的臨床表現和最終轉歸有巨大影響。多種炎癥性細胞因子參與抗結核分枝桿菌感染的防御機制。這些細胞因子包括促炎癥性細胞因子γ干擾素（IFN－γ）和抗炎細胞因子轉化生長因子β（TGF－β）［3-4］。對結核分枝桿菌免疫反應的研究主要集中于肺結核患者，只有少數研究涉及EBTB患者。

本研究檢測EBTB患者支氣管鏡下介入治療前后血清和支氣管灌洗液（bronchial lavage fluid，BLF）中IFN－γ和 TGF－β水平，分析IFN－γ和 TGF－β與EBTB致病機制以及與治療效果之間的關聯性。

對象和方法

一、研究對象

EBTB可疑患者用支氣管鏡檢查。支氣管鏡檢查適應證如下：（1）胸部放射線照片正常，有喘鳴或嚴重咳嗽。（2）與放射線照片不相符合的嚴重呼吸困難。（3）胸部放射線照片正常情況下，痰抗酸桿菌陽性。（4）體格檢查發現局部可聞及喘鳴音。（5）胸部CT提示肺結核伴有支氣管病變患者。通過支氣管鏡活組織檢查顯示慢性肉芽腫炎和BLF結核分枝桿菌培養陽性，EBTB診斷確定。2008年8月至2010年8月上海市肺科醫院結核科住院確診的支氣管結核合并肺結核患者78例，其中炎癥浸潤型支氣管結核12例，潰瘍壞死型45例，肉芽增殖型21例。其中男性25例，女性53例；年齡16～72歲，平均37.2歲。所有的結核病患者HIV檢測陰性。健康對照組：50名健康的體檢人群，無結核病，胸部放射線檢查正常，排除心、肝、腎等疾病，其中男性17名，女性33名，年齡22～60歲，平均年齡35.6歲。

二、研究設計

本研究根據支氣管鏡檢查特征，按照國內學者劉忠令等［5］的分型標準將EBTB分為4型：（1）炎癥浸潤型；（2）潰瘍壞死型；（3）肉芽增殖型；（4）瘢痕狹窄型。前三型合稱非瘢痕期狹窄型。首次抗結核治療2個月后進行支氣管鏡檢查隨訪，氣管鏡檢查隨訪是否存在支氣管的狹窄將支氣管結核患者分成纖維狹窄組和無纖維狹窄組。根據支氣管鏡檢查觀察到支氣管內腔狹窄，并且具有纖維化瘢痕狹窄特征。支氣管的狹窄采用半定量分級：第一級：內腔狹窄小于1／3；第二級：內腔狹窄大于1／3且小于2／3；第三級：內腔狹窄大于2／3。

三、方法

檢測支氣管鏡介入治療前后EBTB患者血清和BLF中IFN－γ和TGF－β水平，以及健康對照者血清IFN－γ和TGF－β水平。通過支氣管鏡，在支氣管結核病變部位行支氣管灌洗，收集BLF。在正常對照組不可能獲得BLF，因此選取10名不明原因咳嗽、胸部CT檢查正常，后經各項檢查未發現異常者作為對照組，收集BLF。收集的血清和BLF標本，置于－80℃保存。檢測時使用IFN－γ和TGF－β ELISA試劑盒，購自上海森雄科技實業有限公司，嚴格按照試劑盒說明書操作。在470nm波長下讀取各孔吸光度（A）值，計算機繪制標準曲線并給出相應數值，以pg／ml表示。

四、統計分析

數據分析采用SPSS 13.0軟件進行，各組均值比較采用非參數的Mann Whitney U檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、支氣管的狹窄位置和等級

最常見的支氣管結核病變部位是左側主支氣管（27例為單純左側主支氣管病變、9例合并左下葉支氣管、6例為右下葉支氣管）。累及的另一個部位是左下葉支氣管（13例）、氣管（7例），左上葉尖段支氣管合并左下葉支氣管（6例）、右上葉支氣管（5例）。右側中間支氣管、右中葉及右下葉支氣管（5例）。支氣管狹窄分級程度如下：第一級12例，第二級13例，第三級53例。

二、胸部CT和肺功能檢查結果

初次支氣管鏡檢查之前，分別對78例患者進行胸部CT和肺功能檢查。胸部CT提示78例患者中67例患者存在支氣管狹窄（85.9%），狹窄范圍從接近正常到完全阻塞。胸部CT掃描未發現11例EBTB，包括7例炎癥浸潤型、5例干酪壞死型肺段支氣管結核。EBTB患者的肺功能16例正常（38%）、16例限制性通氣功能減退（38%），10例混合性通氣功能減退（阻塞性和限制性）（24%）。初次診斷EBTB時，肺功能常見特征為限制性通氣功能減退或者正常通氣功能。

三、EBTB患者血清和BLF中IFN－γ和TGF－β水平

與對照組相比，EBTB患者組的BLF中IFN－γ和TGF－β水平以及血清IFN－γ顯著升高。兩組間血清TGF－β水平差異有統計學意義（U 值分別為16.4846、9.7448、8.2785，P 值均＜0.01）（表1）。

表1 EBTB組和健康對照組血清及BLF中IFN-γ和TGF-β的水平（pg／ml）

表1 EBTB組和健康對照組血清及BLF中IFN-γ和TGF-β的水平（pg／ml）

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表2 治療后有無支氣管纖維狹窄的EBTB患者的IFN－γ和TGF－β水平

四、治療后有無支氣管狹窄的患者BLF和血清中的IFN－γ和TGF－β初始水平

全身抗結核治療和支氣管鏡下介入治療2個月后隨訪，支氣管鏡檢查表明78例EBTB患者中51例患者康復，無支氣管狹窄；另外27例患者發展為支氣管狹窄，其支氣管達到狹窄級別第一級及以上。結果顯示，與無支氣管狹窄的患者相比，支氣管狹窄患者中，BLF中的TGF－β和IFN－γ水平明顯升高，初始血清TGF－β水平比無狹窄患者明顯下降（表2）。

討 論

近年來，抗結核分枝桿菌免疫反應方面的研究取得重大進展，T淋巴細胞和巨噬細胞間相互作用是宿主抗結核分枝桿菌保護性免疫的中心環節，由于這種細胞間的相互作用涉及多種細胞因子，而IFN－γ和TGF－β有活化或者去活化巨噬細胞的能力，因此，細胞因子IFN－γ和TGF－β的作用成為關注的焦點。

研究表明：T淋巴細胞分泌的IFN－γ可活化肺泡巨噬細胞，產生各種活性物質，包括反應性的氧和氮，從而抑制結核分枝桿菌的生長和誘導結核分枝桿菌的死亡。本研究發現，與對照相比EBTB合并肺結核患者血清和BLF中的IFN－γ水平顯著升高。提示IFN－γ在抗結核的全身和局部免疫中均發揮著重要作用。Flynn等［6］證明在IFN－γ敲除小鼠中，肺結核導致大量組織壞死，小鼠更加迅速地死亡。提示IFN－γ對抗分枝桿菌保護性細胞的反應必不可少。Tsao等［3］證明支氣管灌洗液中IFN－γ水平與肺結核疾病嚴重程度有關，抗結核化療后IFN－γ水平下降，與胸部放射線檢查的改善一致。Shijubo等［7］發現粟粒性結核患者血漿IFN－γ水平顯著升高，抗結核治療后，這些患者IFN－γ水平漸進性下降。IFN－γ水平反映抗結核免疫反應強度和炎癥反應的嚴重性。EBTB患者支氣管灌洗液中的IFN－γ明顯升高，反映支氣管局部抗結核免疫反應強度和炎癥反應更加嚴重。

TGF－β是一種重要的巨噬細胞去活化劑，其在人類宿主抗分枝桿菌防御中起作用，主要由單核細胞和巨噬細胞產生。TGF－β的抗炎作用包括巨噬細胞的去激活關聯產生反應性的氧和氮中間體、抑制T細胞增殖、妨礙自然殺傷細胞和細胞毒性T細胞功能，以及下調IFN－γ、TNF－α和IL－1的釋放。Aung等［8］研究表明TGF－β在肺結核患者的肺組織中表達，與IFN－γ觀察結果相反，提示TGF－β可能涉及結核肉芽腫的形成和發生。本研究發現，與IFN－γ不同，EBTB患者與健康對照間血清TGF－β水平差異無統計學意義。另一方面，發現EBTB患者BLF中TGF－β水平比對照組顯著升高，提示TGF－β可能在支氣管局部免疫中發揮功能。與Kim等［9］研究結果一致。全身抗結核治療和支氣管鏡下介入治療后支氣管狹窄的患者中，血清TGF－β初始水平比無支氣管狹窄患者水平低。而且抗結核治療后，與無支氣管狹窄患者相比，支氣管狹窄患者血清TGF－β水平下降明顯。筆者推測TGF－β可能參與EBTB發病機制，并與支氣管纖維性狹窄有關。在EBTB發生過程中，TGF－β水平下降導致調節過度炎癥反應作用降低，最終導致支氣管的纖維性狹窄。

抗結核免疫反應下調和炎癥反應的緩解可能是支氣管結核是否發生支氣管狹窄的關鍵步驟。EBTB發病過程中，高水平的IFN－γ激活巨噬細胞，促使巨噬細胞產生抗菌分子，發揮殺滅結核分枝桿菌的作用。同時造成局部炎癥反應，IFN－γ水平與局部組織壞死密切相關。TGF－β在結核病中主要發揮免疫調節作用，抑制T細胞反應和使巨噬細胞去活化。Toossi等［10］指出，造成結核病損害的細胞因子環境中包含結核分枝桿菌及其成分，且可能特別指TGF－β分泌過高。筆者認為，高水平TGF－β在EBTB中的作用，一方面造成局部組織損傷，另一方面促進支氣管纖維化。因為TGF－β具有促進膠原、纖維連接蛋白和蛋白多糖的合成，抑制膠原酶和蛋白酶的產生，以減少膠原降解的作用，是一種致纖維化因子。EBTB發病過程中，局部高水平IFN－γ和TGF－β造成支氣管內膜組織嚴重損傷，同時TGF－β促進組織纖維化。而且支氣管狹窄患者比無狹窄患者血清中TGF－β濃度低，降低了全身對過度的抗結核免疫反應產生炎癥反應的調控，從而導致支氣管纖維化。通過呼吸道吸入TGF－β抗體，中和局部的TGF－β從而降低其水平，可能是防止支氣管結核致支氣管纖維化的一種新的治療手段［11］。

BLF中TGF－β和IFN－γ水平受收集標本體積、疾病的嚴重性、同時使用局部麻醉劑或血管收縮劑及液體的白蛋白等各種因素的影響。但是本研究結果為闡明EBTB的發病機制提供了一些線索。

［1］Rikimaru T.Endobronchial tuberculosis.Expert Rev Anti Infect Ther，2004，2（2）：245－251.

［2］Williams DJ，York EL，Nobert EJ，et al.Endobronchial tuberculosis presenting as asthma.Chest，1988，93（4）：836－838.

［3］Tsao TC，Huang CC，Chiou WK，et al.Levels of interferongamma and interleukin－2receptor－alpha for bronchoalveolar lavage fluid and serum were correlated with clinical grade and treatment of pulmonary tuberculosis.Int J Tuberc Lung Dis，2002，6（8）：720－727.

［4］Olobo JO，Geletu M，Demissie A，et al.Circulating TNF－alpha，TGF－beta，and IL－10in tuberculosis patients and healthy contacts.Scand J Immunol，2001，53（1）：85－91.

［5］劉忠令，李強.呼吸疾病介入治療學.北京：人民軍醫出版社，2003：130－131.

［6］Flynn JL，Chan J，Triebold KJ，et al.An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection.J Exp Med，1993，178（6）：2249－2254.

［7］Shijubo N，Imai K，Nakanishi F，et al.Elevated concentrations of circulating ICAM－1in far advanced and miliary tuberculosis.Am Rev Respir Dis，1993，148（5）：1289－1301.

［8］Aung H，Toossi Z，McKenna SM，et al.Expression of transforming growth factor－beta but not tumor necrosis factoralpha，interferon－gamma，and interleukin－4in granulomatous lung lesions in tuberculosis.Tuber Lung Dis，2000，80（2）：61－67.

［9］Kim Y，Kim K，Joe J，et al.Changes in the levels of interferon－gamma and transforming growth factor－beta influence bronchial stenosis during the treatment of endobronchial tuberculosis.Respiration，2007，74（2）：202－207.

［10］Toossi Z，Ellner JJ.The role of TGF beta in the pathogenesis of human tuberculosis.Clin Immunol Immunopathol，1998，87（2）：107－114.

［11］Zhang J，Li Q，Bai C，et al.Inhalation of TGF－beta1antibody：a new method to inhibit the airway stenosis induced by the endobronchial tuberculosis.Med Hypotheses，2009，73（6）：1065－1066.