應用線性探針技術快速診斷耐多藥肺結核效果分析

黃玉平 屈亞虹 馬振亞 王瑜 馬樺 朱寧 侯建中

我國是全球27個耐多藥肺結核高負擔國家之一，耐多藥肺結核已經成為我國有效控制結核病的嚴重障礙［1］，危害著人們的身心健康。耐多藥肺結核不但傳播危害嚴重、治療難，而且診斷也很困難。傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)和藥敏試驗診斷方法一般需要3個月，由于診斷需要時間長，在確診為耐多藥肺結核之前不但傳染了其他人，并且用現有的初、復治化療方案治療可能會進一步擴大耐藥譜，因此急需研發(fā)快速檢測耐多藥肺結核的診斷方法。

為了進一步驗證線性探針技術（Hain Geno－Type?MTBDRplus，簡稱HAIN）快速診斷耐多藥肺結核在基層結核病防治工作中的可行性，開封市結核病防治所于2010年應用HAIN對459例涂陽肺結核患者痰標本進行快速檢測耐多藥肺結核，并與傳統(tǒng)方法結核菌培養(yǎng)和藥敏試驗作對照分析。

資料和方法

一、研究對象

2010年4—10月開封市結核病防治所和所轄5縣結核病防治所登記管理的初、復治涂陽肺結核患者。

二、實驗方法

（一）標本收集

縣結核病防治所對每例痰涂片陽性患者留取3份痰標本，痰標本于4～8℃冰箱保存，3d內運送到市結核病防治所。市結核病防治所收到痰標本后，連同本所發(fā)現的陽性痰標本，24h內進行羅氏培養(yǎng)和HAIN檢測。

（二）HAIN檢測方法［2］

1.提取DNA：取500μl處理后痰標本加入1.5ml離心管內，10000×g離心15min；棄上清，加入500μl去離子水，渦旋震蕩重懸沉淀物。10000×g離心15min；95℃水浴中孵育20min；超聲裂解15min。12000×g離心10min，取5μl上清液用于PCR檢測。

2.擴增：在PCR儀上設置以下程序進行擴增：15min 95℃，1個循環(huán)；30s95℃、2min 58℃10個循環(huán)；25s95℃、40s53℃、40s70℃30個循環(huán)；8min 70℃1個循環(huán)；4℃1個循環(huán)。

3.雜交：將PCR擴增產物和變性裂解液（DEN）各20μl混勻加入雜交反應板，孵育5min，然后加入雜交緩沖液（HYB）1ml，混勻，將標記好的探針試條加入槽中，在雜交儀上45℃孵育30min后將雜交液徹底吸出，再加入1ml嚴格漂洗液（STR），45℃雜交儀孵育15min。在每個槽中加入1ml按1∶100稀釋的標志物，雜交儀振動平臺上孵育30min。再向每個槽中1∶100稀釋的底物并靜止避光孵育5～10min。將試條取出置于吸水紙上干燥，然后粘貼在判讀表上。

4.判讀：HAIN試條共有27個反應條帶，可分為4個區(qū)（圖1）。后三區(qū)均為耐藥相關基因探針區(qū)。第二區(qū)是與利福平耐藥相關的rpoB基因探針組。第三區(qū)和第四區(qū)分別是與異煙肼耐藥相關的katG基因探針組和inhA基因探針組。這三區(qū)均是第一條帶為基因位點質控帶，后面為野生位點探針和突變位點探針。判讀時野生條帶都顯色，而突變條帶不顯色判為敏感；而野生條帶有缺失，突變條帶無論顯色或不顯色均判為耐藥（圖2）。

圖1 每個探針試條的27個反應條帶

圖2 判讀實例

（三）結核分枝桿菌培養(yǎng)和藥敏方法

參照文獻［3］的方法，痰標本經標本消化液（10ml 4%氫氧化鈉、10ml 2.94%檸檬酸三鈉、20mg N－乙酰－L－半胱氨酸）前處理，培養(yǎng)基為改良中性羅氏培養(yǎng)基。藥敏試驗用比例法，觀察RFP、INH耐藥情況。

結 果

一、兩種方法耐藥檢測分析

對459例既進行HAIN檢測又進行傳統(tǒng)培養(yǎng)和藥敏試驗的陽性痰標本結果進行對照分析。HAIN檢測與傳統(tǒng)藥敏檢測RFP耐藥率差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝0.038，P＞0.05）；INH耐藥率差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝0.231，P＞0.05）。其傳統(tǒng)培養(yǎng)藥敏試驗和HAIN檢測459例患者耐藥情況見表1。

表1 兩種方法檢測459例患者耐RFP、INH情況

表2 同一標本HAIN檢測與傳統(tǒng)藥敏結果對比（例）

二、對同一標本傳統(tǒng)藥敏試驗和HAIN檢測結果對照分析

兩種方法檢測對RFP均敏感者427例，均耐藥者24例，均耐多藥者12例，二者結果一致率98.3%（451／459）；對INH 均敏感者410例，均耐藥者37例，均耐多藥者12例，二者結果一致率97.4%（447／459）（表2）。

三、與傳統(tǒng)培養(yǎng)藥敏試驗相比

HAIN檢測耐RFP靈敏度82.8%（24／29），特異度 99.3% （427／430）；耐INH靈敏度80.4%（37／46），特異度99.3%（410／413）。同一標本兩種檢測方法結果見表2。

討 論

傳統(tǒng)的耐多藥肺結核診斷方法是對患者的痰標本進行細菌培養(yǎng)和藥敏試驗，需要2～3個月時間得到結果，不能解決耐多藥肺結核患者的早期診斷問題。個別患者由于治療不及時導致治愈率下降，甚至確診時已經死亡。由于傳統(tǒng)藥敏試驗待診時間過長，對指導臨床治療意義有限，患者和醫(yī)生不樂于接受，導致大部分耐多藥肺結核患者沒有得到及時發(fā)現而在社會上傳播他人。因此，探索、驗證快速診斷耐多藥肺結核方法，是控制耐多藥結核病疫情的重要手段。

線性探針技術用于耐多藥肺結核診斷，在我國僅有個別報道，都是對培養(yǎng)后的分離株進行檢測，目前尚無基層結核病防治工作中應用該技術對臨床標本直接進行檢測的報道。

本研究通過對459例肺結核患者涂片陽性痰標本直接提取結核分枝桿菌DNA，擴增后，與標記好的探針試條雜交，根據與RFP耐藥相關的rpoB基因探針組、與INH耐藥相關的katG或inhA基因探針組顯色情況，判定是否耐藥。該技術操作時間不超過24h。解決了傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)和藥敏試驗需時間過長問題，為患者早期治療提供了保證。

本研究結果顯示線形探針技術檢測與傳統(tǒng)藥敏試驗比較，二者耐RFP一致率達98%，耐INH一致率達97%。檢測耐RFP靈敏度82.8%，特異度99.3%，耐INH靈敏度80.4%，特異度99.3%。與李強等［4］報道耐RFP靈敏度88.6%、特異度98.8%，耐INH靈敏度79.3%，特異度98.8%接近；低于菅記涌等［5］報道的耐 RFP靈敏度96.3%，耐INH 靈敏度85.3%。可能與試驗標本不同有關，本研究采用的是患者痰標本直接檢測，后者采用的實驗室分離菌株。本組資料顯示開封市肺結核患者耐藥率較低，可能與初治患者比例高，納入分析的藥敏種類少有關，同時提示當地近年來結核病控制已見成效。

線形探針技術用于基層結核病防治中檢測耐多藥肺結核，具有時間短及特異度、靈敏度高的特點，為耐多藥肺結核的早發(fā)現、早治療提供了診斷依據，在縮短其傳播時間、提高治愈率、減輕疾病負擔、保護健康人群和控制結核病疫情等方面具有重大意義。但由于HAIN需要特殊設備和環(huán)境，操作技術和防污染措施要求嚴格，所以在縣級結核病防治機構應用仍有一定的難度。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部.全國結核病耐藥性基線調查報告（2007—2008）.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：1－3.

［2］中國疾病預防控制中心國家結核病參比實驗室.線形探針耐多藥檢測方法應用評估實施細則.北京：中國疾病預防控制中心，2010：37－47.

［3］中國防癆協會基礎專業(yè)委員會.結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程.北京：中國教育文化出版社，2006：1－117.

［4］李強，趙雁林.197例臨床結核分枝桿菌分離株的快速耐藥性檢測報告.中國防癆雜志，2009，31（12）：709－712.

［5］菅記涌，王嫩寒，易俊莉，等.MTBDR plus方法快速檢測北京地區(qū)臨床結核分枝桿菌分離株利福平和異煙肼耐藥性效果評價.中國防癆雜志，2010，32（10）：611－614.