煙草遺傳標記研究進展

徐雙紅,吳成林,戴林建,*,鐘 軍,孫煥良,潘 著

(1湖南中煙工業有限責任公司,長沙 410007;2湖南農業大學農學院,長沙 410128)

在植物分類學上,煙草(Nicotiana tabacum)屬茄科(Solanaceae)煙草屬(Nicotiana)。煙草屬植物大多數是草本,少數是灌木或呈喬木狀,一年生或多年生。目前已發現 66個煙屬植物種,其中紅花煙草和黃花煙草等一些有經濟價值的種為人們廣為栽培[1]。我國種植的煙草大部分是國外引進品種,育種速度落后于其它作物[2]。筆者認為,煙草的育種一方面應結合植株的表型選擇及一些生理生化指標的測定,另一方面應從分子的層面研究品種選擇問題,使煙草育種得到進一步發展。

遺傳標記主要包括形態學標記(morphological marker)、細胞學標記 (cytological marker)、生物化學標記 (biochemical marker)和分子標記 (molecular marker)4種類型[3]。這些遺傳標記在煙草上已開展了大量的研究,尤以分子標記的發展最為迅速,已成為煙草分子生物學的重要方面[4]。筆者就煙草遺傳標記的研究發展概況及前景進行分析,以期為我國煙草育種提供參考。

1 形態學標記研究

形態學標記是指肉眼直接可見或可通過儀器測量的外部特征,如形態性狀、生理性狀及生態地理分布等特征為遺傳標記,研究物種間的關系、分類和鑒定。煙草外部形態性狀主要有葉形、葉片數、葉脈、葉面積、生長勢、莖圍、株高等。

陳學平等[5]對11個煙草品種成苗期的株高、葉片數、生物產量進行測定分析,發現品種間存在較大差異,曬煙、香料煙和黃花煙的平均株高、葉片數要遠高于烤煙。因此,在苗期可根據株高、葉片數、生物產量作為不同類型煙草間的鑒定依據。相同類型品種的煙草由于在苗期性狀差異不大,形態性狀不能直接作為鑒定指標,還需進行進一步的種植鑒定。

何川生等[6]用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)對37個煙草品種的花粉表面結構進行觀察,發現同一品種煙草花粉表面形態結構無明顯差異,但烤煙、曬煙不同品種之間的花粉表面形態結構存在一定差異。烤煙、曬煙與野生煙之間形態結構差異十分明顯,這種差異主要表現在萌發孔特征和花粉大小上。不同烤煙品種的萌發孔大小和形狀表現出了明顯的遺傳特性,并認為此可以作為煙草分類、進化研究的重要依據。

2 細胞學標記研究

細胞學標記是指能明確顯示遺傳多態性的細胞學特征,如染色體的結構特征及數量特征。染色體結構特征包括染色體的核型、染色體長度、著絲點位置、臂比、隨體大小等。不同物種的染色體具有各自特定的形態結構,且這種形態特征是相對穩定的。

程曉蕾等[7]研究表明,在對煙草染色體制片中,用風油精溶液(20%)進行預處理效果最好,染色體分散度較高,收縮長度適宜,且可顯示一定的帶紋。應用煙草染色體顯帶技術,從核型分類和染色體帶紋的差異來分析煙草不同亞屬間染色體結構上的差異,確定其親緣關系遠近,可為煙草遺傳育種的親本選配等方面提供一定的參考。

3 生物化學標記研究

生化遺傳標記是以生物體內的某些生化性狀為遺傳標記,包括同工酶標記、蛋白質標記、高效液相色譜等方法。一般以同工酶標記和蛋白質標記應用較廣泛。

3.1 同工酶標記

同工酶技術是通過電泳和組織化學方法進行特異性染色,把酶蛋白分子分離開來,并將其相應位置和活性情況直接在染色區帶標記出來,該技術已逐漸成為分子水平研究的一種重要手段[8]。同工酶標記的優點在于環境因素對同工酶標記基本沒有干擾,技術非常穩定,但同工酶標記的局限性在于可選擇的同工酶種類少且其表達存在階段特異性和器官特異性[9]。

侯留記等[10]采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)對10個烤煙品種種子的酯酶同工酶(EST)進行了比較,結果表明,各品種的 EST酶譜可以相互區別,種子EST的PAGE酶譜可鑒別烤煙品種。王蘊波等[11]采用聚丙烯酰胺凝膠電泳,對 6種煙草幼苗中過氧化物酶同工酶數目進行對比,發現不同類型煙草間差異很大。陳學平等[12]針對國外引進烤煙品種和國內選育烤煙品種及一些地方烤煙品種共 64個品種進行酯酶同工酶的分析,結果表明這些烤煙品種種子中的酯酶同工酶具有遺傳穩定的特性,這也說明同工酶標記技術對鑒定烤煙品種有重要意義。許明輝等[13]研究了烤煙與曬煙品種間同工酶的多態性表現,主要包括對種子、不同生育期葉片及花蕾的 9種同工酶進行分析,結果表明花蕾中的過氧化物酶可成為區分烤煙與曬煙的同工酶標記。

同工酶是具有相同催化功能而結構及理化性質不同的酶,其結構的差異來源于基因型的差異,因而個體同工酶差異直接反映著遺傳基礎的差異,所以利用同工酶標記技術對煙草不同群近緣種內或品種間比較,進行遺傳多樣性分析,探討種間分類問題及品種間的相互關系,為形態分類提供佐證,具有重要意義[14]。

3.2 蛋白質標記

作為生化遺傳標記之一,蛋白質標記與同工酶標記的不同點在于其主要是從種子中提取蛋白質,主要檢測醇溶蛋白、清蛋白、球蛋白和谷蛋白等貯藏蛋白質。梁明山等[15]對8個煙草品種的種子水溶蛋白進行鑒定,從得到它們的 SDS-PAGE和 IEF-PAGE電泳圖譜分析,這種水溶蛋白標記具有分辨力高、重復性強的特性,不同品種的電泳圖譜具有明顯的差異,從而可以將其區別開來,認為種子水溶性蛋白圖譜可作為煙草品種鑒定的蛋白質指紋圖譜。盧江平等[16]采用 PAGE鑒別 8個烤煙品種,發現種子醇溶蛋白質和鹽溶蛋白質的 SDS-PAGE能夠清晰的將各品種分辨開來。

4 分子標記

遺傳標記的發展經歷了形態標記、細胞學標記、生化標記到分子標記的過程。分子標記通常指的是DNA分子標記,是 DNA水平上遺傳多樣性的直接反映,表現為核苷酸序列的差異即序列的多態性。其作用是在生物的基因組內或各染色體上提供基因的準確位置,為研究基因的結構、序列、功能及其遺傳和變異規律提供基礎資料。與其它三種遺傳標記相比,分子標記不僅數量巨大,同時也不受環境因素的影響。分子標記可應用于分子標記輔助育種、遺傳圖譜構建、種質資源研究和目的基因定位的研究。目前,應用于煙草研究領域中的分子標記技術主要包括 RAPD(隨機擴增多態性DNA)、AFLP(擴增片斷長度多態性)、SSR(簡單系列重復)、ISSR(簡單重復間序列標記)、SRAP(相關序列擴增多態性)等方法。

4.1 隨機引物擴增DNA多態性標記的應用

RAPD(Random amplified polymorphic DNA)是以基因組DNA為模板,單個人工合成的隨機多態核苷酸序列為引物,通過 PCR擴增產生不同大小的 DNA片段,用于檢測DNA序列的多態性。目前對煙草品種的分子鑒定多基于這種標記技術。盡管 RAPD技術較為簡單快捷,但由于引物較短,擴增結果容易受到實驗條件的影響,重復性較差。

Coussirat[20]以 32個煙草品種為材料,用 160個隨機引物對其分別進行 RAPD分析,結果發現其中有 9個引物擴增的 29條帶可以顯示出這些品種存在著多態性。許明輝等[21]用 235個不同的隨機引物對來源于不同國家的 23個烤煙和曬晾煙品種的基因組進行了RAPD分子標記分析。235個引物中有25個可以擴增出多態性的產物,利用其中16個引物擴增出46條多態性帶。從這些結果看來,煙草品種間能擴增出多態性的引物比例較低,平均每個引物擴增的多態性條帶數僅3.2和2.9條。肖炳光等[22]以29個烤煙品種為材料,采用 RAPD標記技術對其分子指紋和遺傳關系進行了研究。先用100個隨機引物對10個不同烤煙品種進行RAPD標記分析,通過篩選得到18個隨機引物。利用這些篩選得到的引物對 29個烤煙品種的基因組DNA進行擴增,最終得到29個品種的指紋圖譜。通過這些圖譜對照,可對不同烤煙品種進行鑒定。何川生等[23]利用RAPD標記技術對31個烤煙品種進行分析,結果表明這 31個烤煙品種間有明顯差異,利用多個引物可將 31個材料鑒定出來。梁明山等[24]采用改進后的“ROSE法”提取10個煙草品種的基因組DNA,在重復性較好的RAPD標準分析條件下,檢測了煙草10個品種材料基因組的多態性,結果表明其多態性達81.1%。各品種的擴增圖譜差異明顯,可以清晰區別,可作為各品種的 DNA指紋圖譜。

4.2 擴增片段長度多態性標記的應用

AFLP(Amplifiedfragmentlength polymorphism)是基于限制性內切酶和 PCR技術分析遺傳多態性而發展的一種標記方法,它是通過選擇性擴增經限制性酶切過的基因組DNA,從而顯示其片段長度多態性。AFLP技術主要表現在多態性強,能夠分析基因組較大的材料,可在相對較短的時間內產生較多的標記,但技術難度相對 RAPD高。

Ren N等[25]利用 AFLP標記技術對 46個煙草栽培種和7個煙草野生種進行遺傳多樣性分析,結果表明,野生種的遺傳多樣性相比栽培種高。另外,多態性譜帶顯示,普通煙草栽培種中都共同具有N.sylvestris,N.tomentosif ormis或N.otophora的一個特征譜帶,這表明普通煙草的起源與這 3個野生種有關。楊友才等[26]以10個煙草品種為材料,并建立一種適于煙草 AFLP銀染技術的優化體系,以引物 EACT/M-CAC構建了煙草種質資源的 AFLP指紋圖譜,所制得圖譜擴增帶多,多態性強,且質量好。另外利用這種AFLP銀染分析技術,以4對引物檢測到174個多態性位點,這相當于分析了174個有差異的性狀。上述研究充分證實了 AFLP標記在煙草資源遺傳親緣關系分析中,不管是從每個引物擴增出的帶數、具多態性帶數還是多態性帶的比例來看,AFLP標記比 RAPD標記更適合于煙草的多態性檢測[27]。Luca Rossi等[28]利用 6對 AFLP引物組合,在 4個煙草品種 K326,TN90,TN86和Samsun中擴增出了33個多態性標記。這些多態性標記可以很容易地將上述幾個品種區分開來。即使用 K326和 TN90調制后的煙葉作為材料,這些多態性標記仍可以將它們鑒別出來。

4.3 簡單序列重復標記的應用

SSR(簡單序列重復,又稱微衛星標記,Simple sequence repeats)是基因組中短小的重復序列,重復單位極小,一般只含有 2～ 5個核苷酸,重復次數一般為 10～ 15次。由于基本單元重復次數不同,形成了SSR座位的多態性,而每個 SSR座位兩側一般是相對保守的單拷貝序列,因此可以根據兩側序列設計特異PCR引物來擴增 SSR序列,經凝膠電泳分離,可以顯示不同個體在某個 SSR座位上的多態性。

Bindler等[29]首次報道了煙草的 SSR標記遺傳圖譜,總共282個SSR標記擴增的293個位點被定位到煙草的24個連鎖群上。葉蘭欽等[30]利用已經公布的煙草SSR標記信息,分析了云南省煙草品種的 SSR標記遺傳多樣性,并進一步探討利用 SSR標記技術在煙草品種鑒定中的應用。他們通過對92對分布于煙草24個連鎖群的 SSR標記引物進行篩選,發現有20對在這些品種之間存在多態性;并在20個SSR位點上共檢測到52個等位基因,平均每對引物對應的等位基因數為 2.6個。根據SSR標記多態性計算了13個品種之間的遺傳距離介于 0.0090～ 0.4286之間,平均距離為 0.2237,這說明這些云南省煙草品種間遺傳差異較小。

4.4 簡單重復序列間擴增的應用

ISSR(Inter simple sequence repeats),這是近年來分子標記技術發展中的新技術之一,是由 Zietli Ewics等率先開發出的一種標記技術。引物為錨定的微衛星 DNA,是在微衛星標記序列的3′端或5′端加上 2～4個隨機核苷酸,由于在 PCR反應中錨定引物能使特定位點退火,進而導致與錨定引物互補的間隔不太大的重復序列間 DNA片段進行 PCR擴增。所擴增的ISSR區域的多個條帶經凝膠電泳得以分辨,擴增譜帶多為顯性表現。

蔡利等[31]研究表明,ISSR比 RFLP,SSR,RAPD等分子標記的擴增產物多態性都要豐富,相比而言ISSR可提供更多基因組的信息。 ISSR引物比 RAPD引物更長,退火溫度也更高,因此其穩定性和可重復性更佳。目前,ISSR標記技術多用于煙草親緣關系的分析、遺傳多樣性的研究、遺傳圖譜的構建和性狀基因的定位等方面。傅冰等[32]利用ISSR標記對25個煙草種質資源進行了遺傳多樣性的研究分析。他通過篩選50條 ISSR引物最終選取 10%的引物,對 25份不同煙草基因組的 DNA進行有效擴增,結果表明,其多態性比率達到76.0%。梁景霞等[33]應用 ISSR分子標記方法,對煙草屬6個種共96份種質進行遺傳多樣性與親緣關系分析。結果表明,多態性比率高達95.2%。同時顯示這些材料遺傳相似系數在 0.28～ 0.97之間,遺傳多樣性豐富。這表明煙草品種間的遺傳基礎相對狹窄,但種間的遺傳差異相對較大。祁建民等[34]對3份煙草野生種和27份栽培種進行了 ISSR分子標記檢測與聚類分析。從研究結果可以看出,采用ISSR分子標記可清晰地將煙草野生種及栽培種中的烤煙、晾煙、曬煙、白肋煙、香料煙根據其遺傳差異分別聚在不同的類型中。同時可看出煙草野生種的遺傳多態性是十分豐富的,但在煙草栽培種中遺傳多態性相對較差,這反映了煙草栽培種的遺傳基礎較為狹窄。楊本超等[35]利用 ISSR標記分析了 24份烤煙材料的遺傳多樣性。從 100個ISSR引物中篩選出 10個引物,通過凝膠電泳檢測出多態性比率為67.79%。利用 2個多態性好的 ISSR標記可以將這 24份烤煙材料區分開,每個品種都有各自獨特的指紋圖譜,這表明ISSR標記適于煙草品種鑒定和遺傳多樣性研究。肖炳光等[36]以含137個株系的烤煙 DH群體(G-28×NC2326)及其親本為材料,構建了包括 11個 ISSR標記和 158個 RAPD標記、由 27個連鎖群組成的烤煙分子標記遺傳連鎖圖。

4.5 相關序列擴增多態性的應用

SRAP(Sequence related amplified polymorphism),是一種基于 PCR的新型標記技術,于 2001年由美國加州大學 Li與 Quiros兩位博士在蕓薹屬作物上開發而來。這種標記是通過特異的雙引物設計對基因的 ORFs的特定區域進行擴增,通常上游引物長 17 bp,下游引物長18 bp。上引物主要用于對外顯子區域進行擴增,下引物用于特異擴增內含子區域、啟動子區域。其原理是由于不同個體以及物種之間的內含子、啟動子與間隔區長度存在差異,通過擴增會產生多態性[37]。

Budak等[38]采用 ISSR,SSR,RAPD和 SRAP等 4種標記技術,共用30條引物檢測15份野牛草遺傳多態性,結果發現只有 SRAP能將這 15種基因型區分開來。由此可見,相比 ISSR、SSR、RAPD,SRAP這種分子標記技術對檢測親緣關系、建立煙草指紋圖譜更適合。梁景霞等[18]以10個煙草栽培品種為試驗材料,設置煙草 SRAP-PCR反應體系的影響因子的梯度實驗,篩選并建立了重復性、多態性佳的 SRAP-PCR反應條件。新型的 SRAP標記技術比起其它分子標記技術因使用較高的退火溫度和較長的引物,具有擴增穩定、易測序等優點,進而可以提供更多的遺傳信息。

5 問題與展望

在研究作物遺傳多樣性方面,傳統的形態學標記、細胞學標記隨著分子水平技術的不斷提高將逐漸失去研究價值和地位,這些生理生化水平的研究工作存在著很大的局限性和低準確性。相反,高效、準確的分子標記具備廣闊的發展前景。

我國煙草生產上以引進品種為主,品種普遍表現抗病性弱、適應能力差,影響了我國煙草產量與品質的提高。而部分國內選育的品種,大多在生產中表現一般,外觀及內在質量、工藝性狀等均存在不足。又由于常規育種周期長,盲目性大,不利于煙草品種的改良。而利用分子技術對煙草新品種進行遺傳改良,將在煙草遺傳育種研究中起到重要的作用。分子標記技術的出現,通過與常規傳統育種結合,在很大程度上可縮短育種過程和提高育種效率。分子標記輔助選擇(MAS)在現代育種中具有重要意義,是今后育種研究的發展方向,其在許多農作物上取得了較大的進展,在煙草育種方面也逐步成為研究熱點。筆者認為可利用分子標記技術對煙草的遺傳資源進行整理,研究目前國內品種和國外引進品種的遺傳背景,減少育種盲目性。另外,對煙草的育性、抗性、生長發育、產量及其構成因素和品質等進行研究,在有關的染色體連鎖群上找到相應的QTL位點,以便于進行分子標記輔助選擇育種和基因的分離克隆。

這些高速發展并逐步成熟的分子標記技術對進一步確定煙草品種間的親緣關系、構建煙草遺傳圖譜、建立煙草種質資源基因庫、分子標記輔助的 QT L定位等有著明顯的優勢,同時也為不斷繁育出產質優良、抗病性、抗逆性強的品種提供基礎。因此,分子標記技術在煙草研究中的應用具有極重要的理論意義,在煙草育種的實踐中具有指導性作用,同時分子標記技術仍舊存在著廣闊的發展空間。

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