帕金森病模型小鼠吸入硫化氫預防神經退行性病變和運動失調

（李戰永摘 楊卓審校譯自Antioxid Redox Signal,2011,15:343-352）

帕金森氏病是神經退行性疾病之一，神經毒素甲基苯基四氫吡啶（MPTP）可致人和動物出現帕金森病的癥狀和生化改變。硫化氫（H2S）已被證明具有神經保護作用。本研究使用8～10周的C57BL/6J小鼠造模。采用腹腔注射MPTP溶液（20 mg/kg）的方法，每2小時1次，共4次，每只小鼠MPTP總量80 mg/kg。實驗動物分2大組：MPTP給藥組和對照組。MPTP給藥組又分空氣吸入組和H2S吸入組。對照組小鼠腹腔分次注射與MPTP給藥組小鼠等量的生理鹽水。從給藥當天開始，MPTP給藥小鼠置于定制的塑料箱中，每天吸入空氣或混有體積分數為4×10-5H2S的空氣8 h，連續吸入7 d。每天監測吸入不同氣體小鼠的直腸溫度。給藥后第7天觀察各組小鼠的行為學改變，包括曠場實驗、旋轉實驗和懸尾實驗。并作組織學檢查包括酪氨酸羥化酶（TH）含量檢測，TH免疫印記分析，膠質細胞活性測定，TUNEL染色以及免疫熒光共染等。給藥后第1、3、7天分別取腦組織，測定腦內谷胱甘肽含量的動態變化。

研究發現，無論吸入H2S與否，MPTP給藥當天均可顯著降低小鼠的體溫，H2S吸入組小鼠在給藥后第1天和第2天能降低體溫，但給藥后第3～6天未發現體溫降低。與對照組相比，MPTP給藥后可降低曠場實驗中小鼠的運動距離和直立次數，減少小鼠在旋轉實驗中的停留時間，明顯延長懸尾實驗中小鼠的靜止時間。H2S吸入7 d后發現，MPTP給藥導致的曠場實驗中小鼠的運動能力和直立活動降低得到改善，小鼠在旋轉實驗中未見運動障礙，H2S吸入能抑制MPTP導致的懸尾小鼠靜止時間增加（P<0.05）。免疫組化結果顯示，MPTP給藥7 d后，黑質和紋狀體內的TH活性顯著降低，而H2S吸入7 d后可抑制這種TH減少。該結果也經免疫印跡分析方法得到證實。TUNEL染色結果證實，MPTP給藥后1 d可增加黑質核團內凋亡細胞的數量。相反，H2S吸入能抑制MPTP給藥所致的凋亡。免疫熒光雙標記表明TUNEL染色陽性的胞核僅見于黑質，尤其是在TH陽性的細胞核區域。盡管大多數TUNEL陽性細胞核沒有被TH陽性細胞覆蓋，但TUNEL、TH和DAPI三標法顯示有少量TH陽性神經元包含有TUNEL染色陽性的細胞核。這些結果提示至少部分TH陽性神經元因凋亡而丟失。H2S吸入可顯著減少MPTP導致的TUNEL陽性細胞。為進一步確認MPTP給藥后黑質內凋亡細胞的類型，研究采用TUNEL染色分別與神經膠質酸性蛋白（GFAP）和離子鈣接頭蛋白抗體（Iba-1）雙標記的方法。結果GFAP陽性的星形膠質細胞沒有覆蓋任何TUNEL陽性細胞，而Iba-1陽性的小膠質細胞包圍TUNEL陽性細胞。實際上，TUNEL、Iba-1和DAPI三標記顯示大多數TUNEL陽性細胞與小膠質細胞差別明顯，提示凋亡的神經元被激活的小膠質細胞吞噬。上述結果表明，MPTP導致黑質內TH陽性神經元凋亡，而這些凋亡的神經元又被激活的小膠質細胞吞噬。免疫熒光染色表明對照組小鼠腦內黑質和紋狀體很少有活性的小膠質細胞和星形膠質細胞，MPTP給藥后第1天即可增加黑質內活性小膠質細胞和星形膠質細胞的活性。紋狀體內，激活的小膠質細胞在MPTP給藥后第1天增多，而星形膠質細胞在MPTP給藥后第7天增多。H2S吸入能對抗MPTP給藥所致的黑質和紋狀體內的星形膠質細胞和小膠質細胞激活。為探究H2S吸入具有神經保護作用的分子機制，本研究測定了核因子E2相關因子2（Nrf2）調節的基因編碼抗氧化蛋白和去毒酶（GST Mu1，NQO1，HO-1，GST A4，GCLC）的表達水平。結果發現MPTP不影響GST Mu1、NQO1和HO-1表達，但降低GST A4和GCLC的表達，H2S吸入增加MPTP給藥后第1天小鼠的上述5種蛋白基因的表達。這些結果提示吸入H2S可通過上調Ⅱ相去毒酶和抗氧化蛋白來發揮其神經保護作用。此外，MPTP在給藥后第1、3、7天，無論是否吸入H2S，均未顯著影響黑質和紋狀體內還原型谷胱甘肽（GSH）水平以及還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽比率（GSH/GSSG），提示谷胱甘肽水平降低與MPTP和（或）H2S無關。

本研究顯示，連續7 d每天吸入體積分數為4×10-5的H2S，可對抗MPTP導致的帕金森模型小鼠的神經退行性變和運動失調。H2S吸入的神經保護作用與其顯著減少MPTP所致的黑質和紋狀體內含TH神經元丟失有關。H2S吸入可抑制MPTP給藥后第1天黑質紋狀體內神經元的凋亡和神經膠質增生。H2S吸入還能上調黑質紋狀體區Ⅱ相去毒酶和抗氧化蛋白，該作用至少部分與上調Nrf2依賴性抗氧化保護機制有關。總之，本研究結果證明，H2S吸入可對抗MPTP給藥后對小鼠造成的毒性作用。