禽類干擾素研究進(jìn)展

楊俊青,劉西培,劉文青,趙寶華

(河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北石家莊,050016)

1 干擾素

干擾素(Interferon,IFN)是指在特定誘導(dǎo)劑作用下,由細(xì)胞產(chǎn)生的一組具有高度生物學(xué)活性的糖蛋白。最先是由英國(guó)病毒學(xué)家Isaacs和瑞士研究人員 Linden-mann于 1957年在利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感病毒的干擾現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)的[1]。1963年 Lampson等純化了這種因子,并證明該因子是一種蛋白質(zhì),其分子量為 20～34 ku[2]。對(duì)干擾素基因序列研究結(jié)果表明,該序列早在 5億～10億年前就存在于生命細(xì)胞的基因序列中,是生物體內(nèi)一種古老的保護(hù)因子。

近半個(gè)世紀(jì),干擾素一直是病毒學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),但主要是針對(duì)人類及哺乳動(dòng)物干擾素作用機(jī)理及臨床實(shí)驗(yàn)的研究。與人類和哺乳動(dòng)物相比,禽類干擾素的研究相對(duì)落后,尤其是在分子生物學(xué)方面的研究。由于禽類干擾素具有廣譜抗病毒、抗腫瘤活性及免疫調(diào)節(jié)作用,對(duì)禽類疾病的防控有良好作用,近年來(lái)得到了研究人員的重視,目前其基因結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理、體外重組表達(dá)及其在細(xì)胞免疫中的功能等方面的研究都取得了很大進(jìn)展。研究表明,重組干擾素與天然干擾素具有同樣的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)活性[3],因此重組干擾素的研究和應(yīng)用將成為禽類病毒性疾病防治的重要方向。

2 禽類干擾素

20世紀(jì) 80年代,人們按照 IFN與其受體結(jié)合不同的原則,將干擾素分為Ⅰ型與Ⅱ型,而Ⅰ型干擾素又按其與抗體的結(jié)合的抗原性不同分為二類,即 IFN-α和 IFN-β兩大類,Ⅱ型干擾素命名為 IFN-γ。后來(lái),人們不只發(fā)現(xiàn) IFN-α存在亞型以及亞亞型,并且還發(fā)現(xiàn)了牛、羊懷孕時(shí)滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的與胚胎植入發(fā)育和母體識(shí)別有關(guān)的 IFN-τ[4],豬懷孕時(shí)滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的 IFN-δ[5],與 IFN-α同源性極高的IFN-ω,人白細(xì)胞分泌的天然 IFN-ε,角質(zhì)層細(xì)胞分泌的 IFN-κ等也屬于Ⅰ型 IFN。

2003年有兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)在 Nature Immunology發(fā)表兩篇文章,他們發(fā)現(xiàn) IFN-λ1,λ2,λ3或 IL-28A,IL-28B或 IL-29都有干擾素活性,但它結(jié)合的受體與Ⅰ型干擾素受體不同[6]。

劉新恒指出,應(yīng)該將干擾素分為 TypeⅠ,TypeⅡ,TypeⅢ等 3大類型干擾素。其中 TypeⅠ目前分為α,β,κ,ω,ε等數(shù)種。IFN-β,κ,ω,ε等的抗原性均與 IFN-α不同,且本身只有 1種,沒(méi)有亞型或亞亞型,而 IFN-α則有 13種以上亞型,如 IFNα-1,2,3,……,還有亞亞型,如 IFNα-1a,1b,1c,1d及 IFNα-2a,2b,2c,……。TypeⅡ干擾素則只有 1種,即原來(lái)的 IFN-γ。TypeⅢ至今為止有 3種亞型,IFN-λ1,IFN-λ2,IFN-λ3即原來(lái)的 IL-28A,IL-28B和 IL-29[6]。研究表明,雞及其他禽類的 IFN系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物 IFN系統(tǒng)相類似。1995年,Lowenthal等[7]從有絲分裂原刺激的雞脾淋巴細(xì)胞中得到了對(duì)熱和 pH2敏感的 IFN,它能激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生 NO,這與哺乳動(dòng)物 IFN-γ相似,從而證明在雞體內(nèi)同樣存在 IFN-γ。1996年,Sick等 進(jìn)行了 λ噬菌體基因文庫(kù)雜交分析,發(fā)現(xiàn)在雞體內(nèi)存在兩種血清型的Ⅰ型 IFN,進(jìn)一步確證為IFN-α和 IFN-β。到目前為止,雞體內(nèi)還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其他的Ⅰ型 IFN。后來(lái)根據(jù)雞 IFN-γ設(shè)計(jì)多個(gè)引物,得到了 4種 Galliforms(日本鶴鶉、火雞、珠雞和雉)的 IFN-γ基因的全序列[9]。 2008年,Karpala等[10]對(duì)IL-28B的基因進(jìn)行了克隆表達(dá)及純化,這表明禽類體內(nèi)存在 TypeⅠ,TypeⅡ,TypeⅢ等 3大類型干擾素。目前,在禽類中尚未發(fā)現(xiàn) IFN-ω和 IFN-τ等。

3 禽類干擾素的生物學(xué)活性

禽類干擾素與哺乳動(dòng)物干擾素的生物學(xué)活性也相類似,呈現(xiàn)多樣性,以網(wǎng)絡(luò)的形式參與多種生理活動(dòng),是一種重要的細(xì)胞因子,而且在作用機(jī)理和臨床應(yīng)用上的多種生物學(xué)活性之間是相互聯(lián)系、相互交叉的。

3.1 抗病毒作用

IFN并不直接作用于病毒,而是通過(guò)誘導(dǎo)正常細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白(Antiviral protein,AVP)間接地達(dá)到抗病毒的效果,是非特異的,但具有種屬特異性。家禽 IFN-Ⅰ,Ⅱ型均具有廣譜抗病毒作用,Ⅰ型IFN的抗病毒作用最強(qiáng)。首先,IFN與周圍細(xì)胞膜上的受體結(jié)合,起著第一信使的作用,活化細(xì)胞膜腺甘酸環(huán)化酶,促使 cAMP形成;然后 cAMP作為第二信使,激活細(xì)胞內(nèi)抗病毒作用機(jī)制,產(chǎn)生 AVP。AVP主要有 3種:蛋白激酶、磷酸二酯酶和 2-5A合成酶。前 2種能破壞細(xì)胞核糖體轉(zhuǎn)譯病毒蛋白質(zhì),后一種酶能降解 mRNA,有的能抑制轉(zhuǎn)錄酶,阻止 mRNA的形成,還有的能抑制病毒 DNA和 RNA的合成。因此,可以說(shuō) IFN是通過(guò) AVP間接地抑制病毒復(fù)制而達(dá)到抗病毒作用的。禽類 IFN與這 3種酶究竟是如何相互作用,有待進(jìn)一步的探索[11]。

3.2 抗腫瘤作用

IFN-Ⅰ,Ⅱ型都具有抗腫瘤作用,但Ⅱ型效果更為顯著。干擾素抗腫瘤機(jī)制有以下幾種方式:①有些腫瘤的發(fā)生與病毒有關(guān),IFN通過(guò)抑制了病毒的增殖而抑制腫瘤的發(fā)生與成長(zhǎng);②IFN作用于細(xì)胞膜,刺激腺苷酸環(huán)化酶,使 cAMP增加,抑制了 DNA的合成及細(xì)胞分裂;③IFN能改變腫瘤細(xì)胞表面的性能,誘發(fā)新的抗原,從而易被免疫監(jiān)視細(xì)胞識(shí)別并加以排斥;④通過(guò)免疫調(diào)節(jié),增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤能力,主要是增強(qiáng)巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞(CTL)的殺傷性。1999年,Plachy等[12]進(jìn)行了雞重組 IFN防治 RSV腫瘤的研究,結(jié)果表明,高劑量的重組 INF不僅可以抑制腫瘤,還可以使一些雞的RSV肉瘤完全消失。臨床上可用于治療雞馬立克氏疾病、雞白血病、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病、火雞淋巴細(xì)胞增殖病等。

3.3 抗寄生蟲(chóng)作用

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),在宿主對(duì)寄生蟲(chóng)感染的免疫應(yīng)答過(guò)程中,干擾素發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用。其作用主要通過(guò) 3種途徑:①通過(guò)激活巨噬細(xì)胞,增強(qiáng)呼吸頻率,釋放氧自由基,通過(guò)氧自由基攻擊脂質(zhì)膜,使寄生蟲(chóng)體被破壞,從而達(dá)到殺蟲(chóng)目的。Mellors J.W.[13]通過(guò)對(duì)小鼠的研究發(fā)現(xiàn)這種效應(yīng)有組織特異性。②通過(guò) L-精氨酸途徑發(fā)揮作用,由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的 NO,從而抑制靶細(xì)胞的 DNA合成和線粒體的呼吸作用,導(dǎo)致靶細(xì)胞代謝功能障礙。③干擾素可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞合成產(chǎn)生吲哚胺-2,3-雙氧酶,使色氨酸大量分解,導(dǎo)致蟲(chóng)體色氨酸缺乏,從而抑制蟲(chóng)體在宿主體內(nèi)的繁殖。禽類干擾素在抗寄生蟲(chóng)的作用方面,不同類型干擾素作用的途徑是不相同的,Ⅰ型干擾素主要是通過(guò)第 3種途徑而發(fā)生作用,其中 IFN-β抗弓形體的機(jī)制則更為復(fù)雜;Ⅱ型干擾素主要是通過(guò)以上 3種途徑發(fā)揮作用。雞INF-γ可激活感染艾美耳球蟲(chóng)的動(dòng)物的巨噬細(xì)胞,活化 MHCⅡ類分子,提高淋巴細(xì)胞水平,減少卵囊排出量,從而提高雞體重及對(duì)球蟲(chóng)感染的抵抗力[14]。

3.4 免疫調(diào)節(jié)作用

IFN可增加 IgG的 Fc受體表達(dá),從而有利于巨噬細(xì)胞對(duì)抗原的吞噬,K細(xì)胞、NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷,以及 T,B淋巴細(xì)胞的激活,增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答能力[15]。Ⅰ型 IFN可增加 MHCⅠ類分子的表達(dá),從而增強(qiáng)細(xì)胞毒性 T細(xì)胞對(duì)這類靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng),同時(shí)增加 NK細(xì)胞裂解潛能,使機(jī)體有效地發(fā)揮抗病毒感染和抗腫瘤免疫。禽類 IFN-γ可增加細(xì)胞表面 MHCⅡ類分子的表達(dá),調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞之間的關(guān)系,增強(qiáng)免疫應(yīng)答能力[16,17]。

3.5 免疫佐劑作用

細(xì)胞因子作為佐劑始于 20世紀(jì) 80年代初。許多實(shí)驗(yàn)證明,禽類 IFN具有較強(qiáng)的佐劑活性并且對(duì)降低副作用也有一定功效。早在 1991年,A.W.Heath等[18]就發(fā)現(xiàn),重組 IFN-γ與疫苗混合免疫可以明顯提高疫苗對(duì)供試小鼠的免疫保護(hù)效果,而單純使用 IFN-γ對(duì)病原菌無(wú)效。目前,IFN-γ已成為一種常規(guī)選用的免疫佐劑。研究還發(fā)現(xiàn),IFN必須與抗原置于同一位置才能發(fā)揮效應(yīng)。徐守振等[19]將雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng) 3-1E抗原基因與雞 IFN-γ基因進(jìn)行融合,構(gòu)建真核雙價(jià)融合表達(dá)質(zhì)粒,對(duì)肉雞進(jìn)行免疫,具有增強(qiáng)免疫保護(hù)作用,可顯著降低糞便中的卵囊排出量。

4 禽類干擾素應(yīng)用前景

隨著近年來(lái)全球畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展,我國(guó)養(yǎng)禽類已由農(nóng)村家庭副業(yè)發(fā)展成了社會(huì)一大產(chǎn)業(yè),無(wú)論是禽類的品種還是數(shù)量都位于世界前列。然而,養(yǎng)禽業(yè)還存在很多問(wèn)題,禽流感、傳染性法氏囊病、傳染性支氣管炎、馬立克氏病、新城疫等疾病,每年都會(huì)在不同的季節(jié)暴發(fā),造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前禽類傳染性疾病的防治主要采用疫苗免疫和藥物治療,由于疫苗免疫的血清型單一,而病毒的血清型復(fù)雜,毒株變異快,常導(dǎo)致疫苗免疫失敗。一些病毒病目前常無(wú)疫苗可用,有些病毒也可能直接危害到人類的健康。藥物治療主要采用抗生素進(jìn)行治療,但是近年來(lái)由于抗生素的廣泛和大量使用,導(dǎo)致一些抗藥型細(xì)菌的產(chǎn)生,并通過(guò)食物鏈傳染給人,給人類健康帶來(lái)更大的威脅。現(xiàn)在一些國(guó)家己明令禁止一些抗生素和抗菌劑在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用。因此,人們迫切需要開(kāi)發(fā)一種新的方法來(lái)控制畜禽疾病。

干擾素作為一種細(xì)胞因子,已在國(guó)內(nèi)外確證是機(jī)體抗病毒感染防御反應(yīng)中出現(xiàn)最早且對(duì)大多數(shù)病毒均有作用的廣譜抗病毒藥物。禽干擾素除了具有抗病毒、抗腫瘤活性外,更重要的是它具有諸多很重要的免疫調(diào)節(jié)活性,既可以和多種基因工程疫苗聯(lián)用,增強(qiáng)改善其免疫效果,也可以單獨(dú)作為生物制劑使用應(yīng)用于疾病的防治,在醫(yī)學(xué)已被廣泛應(yīng)用于病毒病和腫瘤性疾病的治療。近年來(lái),利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)出重組禽類干擾素,開(kāi)展禽病毒性疾病和腫瘤性疾病的防治越來(lái)越受到人們的重視。

雖然干擾素產(chǎn)品已應(yīng)用于預(yù)防與治療家禽的多種疾病,如在禽流感、新城疫等病毒感染病的防治中具有較好的效果,但是在干擾素研究中,還有一些理論與實(shí)踐方面的問(wèn)題有待進(jìn)一步研究:(1)需要進(jìn)一步研究 IFN受體基因及其分子生物學(xué)結(jié)構(gòu);(2)需要深入研究干擾素與干擾素受體之間的相互作用以及受體在信號(hào)傳導(dǎo)中的作用;(3)需要進(jìn)一步研究不同來(lái)源干擾素的親和性及其生物學(xué)功能;(4)需要探索更有效的基因表達(dá)系統(tǒng),以提高干擾素基因的表達(dá)水平,降低其生產(chǎn)成本;(5)需進(jìn)一步改進(jìn)干擾素的純化和檢測(cè)技術(shù);(6)干擾素與干擾素受體在臨床上還有多大的開(kāi)發(fā)空間。這些問(wèn)題均有待進(jìn)一步深入的研究和探討。

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(責(zé)任編輯:朱寶昌)