新疆塔城地區仔豬黃白痢病原菌的分離鑒定及藥敏試驗

周 軍

（新疆塔城地區畜牧科技研究推廣中心，新疆塔城市 834700）

隨著肉食品價格的不斷升高、國家鼓勵政策的實施，養豬業得到了迅速發展，規模養殖不斷擴大，而困擾養豬業發展的豬病問題（如仔豬黃白?。┯葹橥怀?。仔豬黃白痢發病率高、死亡率高，嚴重威脅養殖業的發展，對其研究已成為世界性的重要課題。加之，近年來由于濫用抗生素，使得細菌耐藥性產生，在規模化養殖的情況下藥物治療也十分困難。

為調查塔城地區仔豬黃白痢發病和流行情況，指導養豬場用藥，更好的從源頭預防控制仔豬黃白痢的發生，筆者對塔城地區的仔豬黃白痢病料中的致病菌進行了分離鑒定，同時做了藥敏試驗。

1 材料

1.1 病料

病料為死亡仔豬腸內容物，來自塔城市、額敏縣、沙灣縣30家規模較大的養豬場。

1.2 培養基及試劑

鮮血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、SS瓊脂平板、伊紅美藍瓊脂平板、普通瓊脂平板；MR試劑、VP試劑、吲哚試劑、過氧化氫試劑、K88陽性血清、氧化酶試劑等。

1.3 藥敏紙片

由北京天壇藥物生物技術開發公司生產。

1.4 實驗動物

健康小白鼠40只，體重17～24 g，雌雄各半。

1.5 紅細胞的制備

分別采集健康豬、綿羊、雞、兔和豚鼠動物血液，5%的檸檬酸鈉抗凝，2000轉/分鐘 離心，生理鹽水洗滌細胞，如此3次，每次10分鐘，最后用0.0l mol/L PBS(pH 7.2)稀釋到1%的工作濃度。

1.6 主要器材

全自動鑒定及藥敏測試儀（ATB Expression）、離心機、GMSX-280手提式壓力蒸汽消毒器、數碼顯微鏡、溫箱、冰箱、SW-CJ-2FD超凈工作臺。

2 方法

2.1 病原分離

將采集的病料接種于EC增菌液，37℃恒溫培養24小時，轉入鮮血培養基37℃恒溫培養24小時，再將分離純化的菌株，接種于麥康凱瓊脂平板、SS瓊脂平板、伊紅美藍瓊脂平板，37℃恒溫培養24小時，觀察分離細菌生長的菌落特點，同時將分離菌抹片，革蘭氏染色，鏡檢。

2.2 用細菌鑒定儀鑒定

隨機每縣市選取一株細菌分別進行鑒定。從山梨醇麥康凱瓊脂平板取1～2個純化的菌落，用生理鹽水稀釋到0.5個麥氏單位，取細菌菌液200 μL接種于液體培養基，混勻；用連續加樣器將帶有細菌的培養基，分別加入鑒定條的32個孔，每孔135 μL，蓋好鑒定條的蓋子，放入溫箱30℃恒溫培養24小時。打開蓋子，用細菌鑒定儀鑒定。

2.3 生化試驗

常規生化試驗，37℃恒溫培養72小時，觀察記錄結果（見表1）。

2.4 用血凝方法鑒定其K抗原血清型

原理：K88不能凝集綿羊紅細胞，但能凝集雞、豬、豚鼠、兔的紅細胞；K99株不能凝集兔的紅細胞，但能凝集雞、豬、豚鼠、綿羊的紅細胞；987p全部不凝集；F41全部凝集。當大腸桿菌菌毛粘附于各種動物紅細胞上時，能使紅細胞發生凝集，且不被D-甘露糖抑制，系一種甘露糖抵抗血凝反應(MRHA)。

菌毛的制備：分別將30株培養好的細菌用0.01 mol/L pH 7.2的PBS洗滌并轉移到20 mL滅菌離心管中，8000轉/分鐘 離心15分鐘，稱取細菌細胞的濕重，以0.1 g/mL濕重菌量懸浮于0.01 mol/L pH 7.2的PBS緩沖液中，60℃水浴振搖30分鐘脫菌毛，經10000轉/分鐘 4℃離心15分鐘，吸取上清液20 mL置磁力攪拌器上緩慢加入研細的(NH4)2SO4（終濃度為30%），邊加邊攪拌，待 (NH4)2SO4完全溶解后，置4℃冰箱過夜，4℃15000轉/分鐘 離心40分鐘，沉淀溶于2 mL 0.01 mol/L的PBS中備用。

鑒定方法：先做血凝預試驗，以能明顯凝集紅細胞供試液的最高稀釋倍數作為該黏附素抗原的血凝效價。取96孔板每孔加入50μL含1%D-甘露糖的PBS液（共31行5列），前30行每孔加入50 μL菌毛提取液第31行每孔加入 50 μL含 1%D-甘露糖的 PBS液做對照，1～5列依次加入1%的豬紅細胞、1%的綿羊紅細胞、1%的雞紅細胞、1%的兔紅細胞和1%的豚鼠紅細胞液50 μL，放微量震蕩器上震蕩2分鐘，然后放到4℃冰箱，3小時后觀察結果。

2.5 致病性試驗

將小白鼠隨機分成4組，每組10只，即塔城市、額敏縣、沙灣縣及對照組。將分離到的各菌株腹腔注射，每只小鼠3×108CFU的菌液，對照組注射生理鹽水0.2 mL/只，觀察接種菌液后72小時內小白鼠死亡情況，并將死亡小白鼠的心、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、血液接種于鮮血瓊脂平板上，37℃恒溫培養24小時，抹片、染色、鏡檢，觀察是否為接種菌株。

表1 30株細菌的生化培養的結果

表2 K抗原鑒定結果

表3 30株細菌人工感染小白鼠致死的結果

2.6 藥敏試驗

將分離的菌株（30株都進行了藥敏試驗，由于結果大致相同，所以只選擇塔城市、額敏縣、沙灣縣各一株的數據列入表中）接種于麥康凱平板上，貼上藥敏紙片（20種藥物），37℃恒溫培養24小時，觀察抑菌圈直徑。

3 結果及分析

3.1 細菌鑒定儀鑒定結果

三株（塔城市、額敏縣、沙灣縣各選一株）均為大腸桿菌。

3.2 分離細菌的培養特性、形態特征

從病料中采集、分離到的30株細菌，培養特性基本一致。在普通營養瓊脂平板上，生長菌落呈圓形、濕潤、表面光滑、邊緣整齊、乳白色小菌落，接種在麥康凱瓊脂平板上呈粉紅色圓形菌落；在SS瓊脂上呈圓形深紅色菌落，在伊紅美藍瓊脂上產生黑色帶金屬閃光的菌落。革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性小桿菌。其培養特性和外觀與大腸桿菌最為相似，初步鑒定為大腸桿菌。

3.3 生化試驗的結果

30株細菌的生化培養實驗結果基本相同，但有量的差異，見表1。其生化特性均符合大腸桿菌的標準，可判定為大腸桿菌。

3.4 血凝試驗K抗原鑒定結果

凡是5種紅細胞都不凝集的，為987p（由于這30株細菌在提取菌毛和做血凝試驗時，所有的操作是完全相同的，所以由于沒有提取到菌毛而與5種紅細胞不凝集的可能性幾乎沒有），見表2。

3.5 動物實驗的結果

塔城市、額敏縣、沙灣縣所分離到的細菌均有致病性，毒力強弱順序為額敏縣＞沙灣縣＞塔城市，見表3。

3.6 藥敏試驗的結果

塔城市的菌株除了對慶大霉素、頭孢曲松敏感，對痢特靈中度敏感外，對其他藥物全部耐藥；建議塔城市的豬場治療用藥時選用慶大霉素、頭孢曲松。

額敏縣的菌株除了對慶大霉素、頭孢曲松敏感，對氟哌酸中度敏感外對其他藥物全部耐藥；建議額敏縣的豬場治療用藥時選用慶大霉素、頭孢曲松。

沙灣縣的菌株除了對慶大霉素、痢特靈敏感，對氟哌酸中度敏感外，對其他藥物全部耐藥；建議沙灣縣的豬場治療用藥時選用慶大霉素、痢特靈?？傊?，三個縣市分離到的菌株均對慶大霉素敏感。建議養豬場（戶）交叉用藥，防止細菌耐藥菌的產生（見表4）。

表4 藥敏試驗數據表