血紅蛋白誘導的HO-1對離體星形膠質細胞損傷作用的研究*

陳 浩 ，王興啟 ，崔桂云 ，趙 輝 ，宋遠見 ，高 麗 ，荊 佳 ，沈 霞

（1.徐州醫學院附屬醫院 神經內科，江蘇 徐州 221004；2.南京大學生命科學學院，江蘇 南京 210093；3.徐州市中心醫院 神經內科，江蘇 徐州 221009；4.徐州醫學院 神經生物學教研室，江蘇 徐州 221004；5.南京醫科大學附屬腦科醫院 神經內科，江蘇 南京 210029）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是神經科常見的急、危、重癥，其發病率、致殘率及死亡率均很高，嚴重威脅著人類健康。研究證實Hb與出血后腦損傷密切相關，作為Hb的分解代謝限速酶HO-1對疾病的發展具有重要影響。研究證實，誘導HO-1高表達可減輕神經細胞損傷而過高表達卻會進一步加重神經細胞損傷[1-2]。已有實驗證實3～30μmol/L Hb誘導的HO-1對星形膠質細胞具有保護作用[3]，那么更高濃度的Hb誘導的HO-1對星形膠質細胞的作用卻未見相關報道。故本實驗將選擇更高濃度的 Hb（40μmol/L）誘導 HO-1表達，觀察 HO-1對體外培養的星形膠質細胞的影響，研究結果將為進一步了解Hb誘導的HO-1在出血性腦疾病中的作用提供新觀點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD大鼠（1 d），由徐州醫學院實驗動物中心提供。高糖DMEM培養基購于GIBCO公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；HO-1羊多克隆抗體購于Santa Cruz公司；Hb、ZnPPIX、β-actin 兔單克隆抗體、Bax小鼠單克隆抗體、Bcl-2兔單克隆抗體、p-JNK小鼠單克隆抗體及JNK兔單克隆抗體購于Cell Signal公司；GFAP兔單克隆抗體購于博士德公司；CCK-8購于日本同仁公司；Hoechst 33342試劑盒購于碧云天生物技術公司；RT-PCR試劑盒購于天根生物公司。

1.2 星形膠質細胞培養及鑒定

參照DALLAS等[4]的方法，取新生24 h內的SD大鼠，超凈臺內無菌條件下斷頭取腦分離出大腦皮層剪碎，胰酶消化、離心、吹打及過濾后，接種于培養瓶內，放入37℃，5%二氧化碳飽和濕度培養箱內培養。5～7 d傳代1次，傳到第3代時，采用GFAP對細胞進行鑒定。

1.3 分組

實驗分為3組，對照組（Control組，簡寫：C組）：僅用DMEM培養基；Hb組：含有40 μmol/L Hb的DMEM培養基及Hb+ZnPPIX組（簡寫：HZ組）。10 μmol/L ZnPPIX預孵育2 h，吸出后再加入含40 μmol/L Hb的DMEM培養基。Hb作用時間為6 h。

1.4 Hoechst 33342細胞核染色

將第3代星形膠質細胞種于24孔板內，干預處理后，用預冷的PBS漂洗后加入預冷的4%多聚甲醛，加200μL/孔的Hoechst 33342染色液，室溫放置3～5 min，吸盡Hoechst 33342染色液，PBS漂洗，選用340 nm的激發光觀察。在20×10倍下每組至少選擇4個視野計數細胞凋亡率，并且避開培養孔的四周區域。

1.5 CCK-8測定細胞存活率

將星形膠質細胞種于96孔板，干預處理，同時設一空白對照組（未進行任何處理），陰性對照組（不加CCK-8），其他實驗組用滅菌的PBS漂洗1遍，每孔加 100μL的 DMEM培養基后再加入 10μL CCK-8溶液，細胞培養箱內孵育4 h，酶標儀450 nm下測各孔吸光度。

1.6 Western blot檢測 HO-1、Bax和Bcl-2的表達

取等量蛋白樣品加入10%SDS-PAGE分離后，以半干轉法轉至NC膜上，加入脫脂牛奶室溫搖床封閉2 h；分別加入稀釋的一抗，4℃過夜；次日洗脫緩沖液洗膜，分別加入相應二抗室溫孵育2 h，洗膜；BCIP/NBT顯色后條帶經圖像處理儀進行激光掃描、定量分析及打印。蛋白激活水平以免疫印跡中相應條帶的灰度值相對于內參組的比值來表示。

1.7RT-PCR檢測HO-1的mRNA

按上述分組處理完畢后，參照總RNA抽提說明書對總RNA進行抽提，逆轉錄及聚合酶鏈反應。HO-1的上下游引物：5'-ACGGCCCTGGAAGAGGA-GATAG-3'和5'-GAGTGTTCATGCGAGCACGATAG-3'（PCR條件：退火溫度60℃，30個循環）；β-actin上下游引物：5'-GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3'和 5'-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3'（PCR 條件：退火溫度60℃，30個循環）。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳后，將凝膠放于Tanon凝膠成像分析系統分析。

1.8 統計學分析

采用SPSS 16.0統計軟件包進行數據分析，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 星形膠質細胞鑒定結果

星形膠質細胞傳代至第3代時應用GFAP抗體免疫熒光鑒定，陽性率達97%，結果說明絕大多數細胞為星形膠質細胞。見圖1。

圖1 星形膠質細胞鑒定結果（GFAP標記，×200）

圖2 RT-PCR及Western blot法檢測HO-1的mRNA及蛋白表達變化

2.2 Western blot及RT-PCR法檢測HO-1的變化

Western blot及RT-PCR技術檢測各組HO-1蛋白及mRNA的表達情況，每組分別重復3次后進行數據統計，分析結果顯示：Hb組、HZ組與C組相比，HO-1蛋白及其mRNA表達量明顯增多，P＜0.001差異有顯著性；HZ和Hb相比，HO-1表達降低，但P＞0.05差異無顯著性。見圖2。

2.3 Hoechst 33342核染色觀察細胞損傷

分析結果說明：Hb組、HZ組和C相比，細胞凋亡率明顯升高，P＜0.001差異有顯著性；HZ組和Hb相比，細胞凋亡率顯著降低，P＜0.01差異有顯著性。見圖3和附表。

附表 各組Hoechst 33342核濃染率及CCK-8檢測細胞存活率的比較 %

2.4 CCK-8檢測細胞存活率

CCK-8檢測結果示：Hb組、HZ組和C相比，細胞存活率明顯降低，P＜0.001差異有顯著性；HZ和Hb相比，細胞存活率明顯提高，P＜0.01差異有顯著性。見附表。

圖3 Hoechst 33342核染色觀察各組細胞損傷情況

2.5 Western blot進一步檢測 Bcl-2、Bax及p-JNK的變化情況

圖4 Western blot檢測各組p-JNK、JNK、Bcl-2和Bax變化情況

結果顯示：Hb組、HZ組與C組相比，Bcl-2/Bax的比值下降，而p-JNK/JNK比值上升，P＜0.01差異都有顯著性；HZ組與Hb相比，Bcl-2/Bax的比值上升，而p-JNK/JNK比值下降，P＜0.05差異都有顯著性。見圖4。

3 討論

Hb約占成熟紅細胞蛋白總量的95.00%，ICH發生時紅細胞裂解釋放出大量的Hb，而Hb會進一步分解產生大量血紅素。因此，將導致出血周圍神經組織暴露于血紅素中。ICH導致的腦損傷主要是由氧化應激反應和炎癥反應等引起的，而Hb代謝產生的血紅素是ICH腦損傷中過氧化劑和自由基的重要來源。血紅素可以被其分解代謝限速酶血紅素氧合酶繼續分解代謝為鐵、一氧化碳及膽綠素。目前發現HO存在 3種同工酶：HO-1、HO-2和HO-3。HO-1又稱熱休克蛋白-32，為可誘導型，可被多種因素如重金屬、熱休克、缺血-再灌注、缺氧、高氧和Hb等誘導表達；HO-2及HO-3為原生型在體內持續表達[5]。雖然HO-1可以分解代謝血紅素降低其對神經系統的損傷作用，但目前有關HO-1在神經細胞損傷或保護中的作用卻存在著爭議[1-2]，這主要與HO-1被誘導表達的水平情況有很大關系。MOON等研究發現梓實糖苷能通過誘導Neuro-2a高表達HO-1抵抗過氧化氫的損傷[6]；然而又有研究證實HO-1能夠加重ICH發生后早期腦損傷[2]。那么不同濃度的Hb誘導的HO-1對星形膠質細胞的作用如何呢？RAYMOND F.REGAN發現3～30 μmol/L Hb誘導的HO-1對星形膠質細胞損傷具有保護作用，但本實驗進一步研究發現40 μmol/L Hb誘導的HO-1對離體星形膠質細胞卻有損傷作用。

在本研究中星形膠質細胞的損傷是否與HO-1過高表達有關，筆者采用了HO的活性抑制劑ZnPPIX抑制HO-1的活性，觀察星形膠質細胞的損傷情況。值得注意的是，大量的研究已經證實ZnPPIX對HO-1的表達沒有影響但對HO-1的活性有很強的抑制作用[7]。本實驗結果顯示ZnPPIX可減輕40μmol/L Hb對星形膠質細胞的損傷作用。

為觀察40μmol/L Hb誘導的HO-1對星形膠質細胞的作用，本組通過RT-PCR及Western blot檢測HO-1的mRNA及蛋白表達量并利用CCK-8及Hoechst 33342核染色檢測細胞活力變化及細胞核濃染情況。結果顯示當HO-1蛋白被誘導過高表達時，星形膠質細胞有明顯損傷發生，而ZnPPIX作用后損傷明顯減輕。研究發現JNK、Bcl-2和Bax等蛋白參與多種細胞的存活或凋亡過程，且目前已有大量研究證實它們也與神經細胞的存活或凋亡有關系[8]。Bcl-2和Bax二者含量和功能狀態之間的平衡是調控細胞凋亡的重要機制。研究認為在一定范圍內，Bcl-2/Bax的比值增高時對細胞有保護作用，但比值減小時則對細胞有損傷作用[9-10]。JNK被磷酸化激活后可促進Bax的表達而下調Bcl-2，從而促進細胞凋亡[11]。本實驗Western blot結果顯示當HO-1蛋白被誘導過高表達時p-JNK/JNK的比值明顯升高，Bcl-2/Bax的比值則明顯下降；而ZnPPIX作用后p-JNK/JNK的比值降低，而Bcl-2/Bax的比值則明顯上升。Western blot結果與CCK-8及Hoechst 33342檢測結果一致。以上結果說明，40μmol/L Hb作用于星形膠質細胞后HO-1的表達水平過高，進而降低細胞存活率，提高JNK磷酸化水平及降低Bcl-2/Bax比值，增加細胞核濃染率促進細胞凋亡。

綜上所述，本實驗說明40μmol/L Hb誘導的HO-1對星形膠質細胞具有損傷作用，此研究結果豐富了對HO-1在Hb導致的星形膠質細胞損傷中的認識。此外，本研究結果也進一步解釋了HO-1能夠加重ICH發生后腦損傷的原因，這可能是病人發生ICH后出血周圍腦組織中HO-1的表達量已超過其具有神經保護作用的水平而處于過高表達狀態，其后果會加重神經組織中如星形膠質細胞的損傷。以上認識將對ICH發生后腦損傷的有效防治提供相關理論依據。

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