芎芍膠囊對心肌梗死大鼠缺血心肌mRNA表達(dá)水平的影響*

嚴(yán) 萍 林久茂 陳宇寧 趙錦燕

莊群川2 陳美華1 葉 盈2 黃飛翔1

1福建省中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院（福建福州 350003）

2福建省中西醫(yī)結(jié)合研究院（福建福州 350003）

芎芍膠囊對心肌梗死大鼠缺血心肌mRNA表達(dá)水平的影響*

嚴(yán) 萍1△林久茂2陳宇寧1趙錦燕2

莊群川2陳美華1葉 盈2黃飛翔1

1福建省中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院（福建福州 350003）

2福建省中西醫(yī)結(jié)合研究院（福建福州 350003）

目的 用RT－PCR檢測中成藥芎芍膠囊對心肌梗死大鼠缺血心肌血管新生作用。方法采用開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的方法建立心肌梗死模型，SD大鼠分為模型對照組和芎芍膠囊高、中、低劑量組，灌胃給藥，連續(xù)給藥6周；RT－PCR法檢測缺血心肌EGF、VEGF、TGF-β1、PDGF-A、PDGF-BB等促血管生成因子的表達(dá)。結(jié)果其中芎芍膠囊低、中、高劑量組VEGF、EGF與模型對照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高劑量組對VEGF的促進(jìn)作用較中、低劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中劑量組對EGF的促進(jìn)作用較高、低劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對照組對TGF、PDGF促進(jìn)作用較高、中、低劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論芎芍膠囊具有促進(jìn)心肌梗死大鼠缺血心肌血管新生、提高心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞VEGF、FGF、EGF蛋白的表達(dá)、具有保護(hù)心肌缺血性損傷的作用。

芎芍膠囊 心肌梗死 血管新生 RT-PCR

芎芍膠囊由川芎、赤芍組成，是取其有效作用部位川芎總酚和赤芍總苷制成，具有活血化瘀、通脈止痛的功效。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用芎芍膠囊在心肌梗死大鼠上觀察缺血心肌血管新生的影響，并通過用RT－PCR法檢測心肌組織中表皮細(xì)胞生長因子（EGF）、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）、血小板源生長因子（PDGF）等促血管生成因子的表達(dá)，初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 芎芍膠囊（北京西苑醫(yī)院，批號(hào)：Z20053499），按成人臨床用量的10倍、5倍及相等劑量配制成高、中、低3種劑量，濃縮至所需的濃度，于4℃保存待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD雄性大鼠32只，體質(zhì)量250～280g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供 [許可證號(hào)SCXK（滬）2007-2005]。

1.3 主要儀器 顯微鏡：日本奧林巴斯 BX51T-PHD-J11；CMOS：日本奧林巴斯。多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)：美國Media Cybernetics公司Image-Pro Plus。切片機(jī)：德國萊卡RM2015。Trizol試劑盒等。

1.3 模型復(fù)制 分批對大鼠腹腔注射氯胺酮和安定復(fù)合麻醉后，取仰臥位，術(shù)區(qū)備皮消毒，氣管插管，呼吸機(jī)輔助通氣（300mL/min）。取第2肋間水平橫切口，剪斷胸骨，切開心包，暴露主動(dòng)脈根部，鉗夾左前降支動(dòng)脈暫時(shí)阻斷血流30min后，松開鉗夾的左前降支動(dòng)脈，壓迫穿刺口止血，關(guān)胸復(fù)蘇。為防止術(shù)后感染，每日肌注青霉素40萬U/只，連續(xù)3d。

1.4 分組與給藥 清潔級(jí) （或SPF級(jí)）SD大鼠32只 （雌雄各半）分為4組（即高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型對照組），每組8只，芎芍膠囊按成人臨床用量的10倍、5倍及相等劑量配制成高、中、低3種劑量濃縮至所需的濃度，進(jìn)行灌胃給藥，模型對照組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥6周后取新鮮凍存心肌組織80mg備用。

1.5 RT-PCR 取總RNA 1μg，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 PCR 反應(yīng)體系 （20μL 體系）：cDNA 1μL，10×Taq Buffer（含 Mg2+） 1.5μL，10mM dNTP 0.2μL，5U/μL Taq 酶 0.2μL，上下游引物各0.3μL，加DEPC水至20μL，震蕩混勻，置PCR儀擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3min；94℃變性40s，退火40s，72℃延伸 45s；72℃終末延伸 10min，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，于凝膠成像分析系統(tǒng)中掃描分析條帶。選用b-actin為內(nèi)參照基因。PCR引物見表1。

表1 EGF、EGFR和 -actin基因的特異性引物

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用STATA 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。定量數(shù)據(jù)首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差不齊者對原始數(shù)據(jù)對數(shù)轉(zhuǎn)換達(dá)到方差齊性后進(jìn)行F檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

芎芍膠囊均不同程度促進(jìn)VEGF、FGF、EGF的分泌，與模型對照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量組對FGF的促進(jìn)作用較中、低劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；中劑量組對EGF的促進(jìn)作用較高、低劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量組對PDGF-BB促進(jìn)作用較高、低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型對照組對 TGF、PDGF-A 促進(jìn)作用較高、中、低劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、圖2。

3 討 論

VEGF、FGF、EGF、TGF、PDGF 都是具有促血管新生作用的生長因子。血管生長因子可以通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長和遷移，誘導(dǎo)、促進(jìn)血管新生，促進(jìn)其相關(guān)組織的生長和修復(fù)。其主要機(jī)制包括：促進(jìn)心肌和周圍血管新生；促進(jìn)粥樣硬化斑塊再內(nèi)皮化；促進(jìn)心肌梗死組織愈合；促進(jìn)血栓再通；通過改善微血管功能失調(diào)治療充血性心功能失調(diào)[1]。

圖1 不同因子PCR產(chǎn)物電泳條帶圖

圖2 各組大鼠心肌 TGF，F(xiàn)GF，VEGF，EGF，PDGF-A，PDGF-B mRNA表達(dá)圖

本研究顯示，芎芍膠囊組對 VEGF、FGF、EGF、PDGF-BB 與對照組比較有明顯的促進(jìn)作用，對照組對TGF、PDGF-A促進(jìn)作用較芎芍膠囊好，可能的原因：（1）TGF在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中是雙向調(diào)控因子，一方面能緩解損傷反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞、促進(jìn)修復(fù)，抑制粥樣斑塊的形成，另一方面又引起細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積、組織纖維化、參與再狹窄、血管和心肌重塑等系列的病理變化[2]。 （2）PDGF不僅產(chǎn)生于血小板，亦可來源于平滑肌，內(nèi)皮細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞。PDGF有3種異構(gòu)體：PDGF-AA、PDGF-AB和 PDGF-BB[1]，它們具有強(qiáng)大的促 VSMCs增殖和向內(nèi)膜下遷移的作用。在血管損傷早期主要來自血小板α顆粒，增生VSMCs釋放的PDGF可能在內(nèi)膜增生晚期更為重要，球囊損傷后，培養(yǎng)的內(nèi)膜VSMCs的PDGF樣活性物質(zhì)分泌增加，PDGF-B受體和PDGF-A鍵mRNA表達(dá)亦增加，將PDGF-A和PDGF-B兩種不同的表達(dá)載體導(dǎo)入豬的髂動(dòng)脈，發(fā)現(xiàn)PDGF-B可以促進(jìn)內(nèi)膜的增生和VSMCs向內(nèi)膜下遷移，而PDGF-A無此作用。應(yīng)用PDGF-A或PDGF-B的抗體，發(fā)現(xiàn)只有PDGF-B抗體可以阻止和抑制內(nèi)膜下增生，提示在內(nèi)膜損傷和再狹窄的形成中，PDGF-BB可能是主要成分，對PDGF效果差是否因各種生長因子出現(xiàn)的時(shí)間是否是不同步有關(guān)；Cercek發(fā)現(xiàn)，球囊損傷后PDGF-B鍵mRNA表達(dá)在頭3天增加2倍，第7天達(dá)高峰，2周恢復(fù)基礎(chǔ)狀態(tài)[3]。芎芍膠囊觀察6周，是否與時(shí)間有關(guān)。

本研究表明，芎芍膠囊具有促進(jìn)心肌梗死大鼠缺血心肌血管新生、提高心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞VEGF、FGF、EGF蛋白的表達(dá)、具有保護(hù)心肌缺血性損傷的作用。但有關(guān)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

[1]吳永全，袁良，胡大一.生長因子在PTCA術(shù)后再狹窄形成中的作用[J].國外醫(yī)學(xué)：心血管疾病分冊，1999，26（2）：75-77.

[2]張文宗，林鐘香.轉(zhuǎn)化生長因子-β1在冠心病中的研究進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2008，24（21）：3779-3781.

Effect ofXiongshao Capsuleon mRNA Expression in Myocardial Ischemia of Rats with Myocardial Infarction

YAN Ping1，LIN Jiu-mao2，CHEN Yun-ning1，et al
1TheSecondPeople'sHospitalAffiliatedtoFujianUniversityofTraditionalChineseMedicine（Fuzhou350003，F(xiàn)ujian）
2Academy of Integrative Medicine，F(xiàn)ujian Province（Fuzhou350003，F(xiàn)ujian）

Objective：To detect the myocardial neovascularization effect of theXiongshao Capsuleon myocardial ischemia rats.Methods：The myocardial ischemia model was established by ligating the left anterior descending branch of the coronary artery.These SD rats were divided into the model control group，theXiongshao Capsulehigh dose group，theXiongshao Capsulemiddle dose group and theXiongshao Capsulelow dose group.After 6 weeks，the angiogenic factors in the angiogenesis such as EGF，VEGF，TGF-β1，PDGF-A and PDGF-BB.Results：There were some statistical differences in the VEGF，EGF，TGF and PDGF among 3Xiongshao Capsulegroups and the control group.Meanwhile，compared with the middle dose group and the low dose group，the increase of the high dose group was more significant in the VEGF.Compared with the high dose group and low dose group，the improvement of middle group was more obvious in EGF.Conclusion：Xiongshao capsulecan improve the myocardial neovascularization and increase some proteins expressions including VEGF，F(xiàn)GF and EGF.It has the effect of myocardial ischemia injury.

Xiongshao Capsule；Myocardial ischemia；Myocardial neovascularization；RT-PCR

R285.5

A

1004-745X（2011）09-1426-02

陳可冀中西醫(yī)結(jié)合發(fā)展基金資助項(xiàng)目（CKJ2008043 2008J1004-06）

△通信作者

2011-04-12）