三七總皂苷對新生大鼠心肌細胞肥大的影響及機制

謝 輝 陶連方

湖北醫藥學院附屬人民醫院（湖北十堰 442100）

三七總皂苷對新生大鼠心肌細胞肥大的影響及機制

謝 輝 陶連方△

湖北醫藥學院附屬人民醫院（湖北十堰 442100）

目的 在原代培養的新生大鼠心肌細胞上，觀察三七總皂苷對血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導的心肌細胞肥大的影響。方法采用MTT法檢測細胞毒性；采用相差顯微鏡測量細胞大小，3H-亮氨酸摻入法測定心肌細胞蛋白質合成速率作為心肌細胞肥大的指標；RT-PCR檢測心肌細胞原癌基因c-fos mRNA的表達。結果三七總皂苷能抑制AngⅡ誘導的心肌細胞增大，蛋白質合成速率的顯著增加及心肌細胞原癌基因c-fos mRNA表達的增強，其效果與AngⅡ受體阻滯劑纈沙坦相似。結論三七總皂苷可以抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大，這與其抑制了原癌基因c-fos的表達有關。

血管緊張素Ⅱ 三七總皂苷 心肌細胞肥大 c-fos

△通信作者

三七總皂苷（Panax notoginseng saponin）是五加科植物三七[Panax notoginseng（Burk．） F．H．Chen]的主要活性成分，含量約為12%；可抑制血栓形成，擴張外周血管，保護缺血性心肌細胞損傷，降低血壓，治療心腦血管疾病療效顯著[1-2]。已有研究表明三七總皂苷具有改善心功能保護缺血心臟的作用[3-4]。但其是否從細胞水平影響心肌細胞凋亡而發揮對心肌細胞的保護作用，文獻少有報道。為此，本實驗以AngⅡ誘導新生乳鼠心肌細胞凋亡為模型[5]，觀察三七總皂苷對心肌細胞凋亡的影響，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）動物：1～3d齡wistar大鼠，雌雄不拘（湖北醫藥學院動物實驗中心提供）。（2）試劑與儀器 ：AngⅡ（Sigma公司）、三七總皂苷（麗珠集團利民制藥廠，批號0711129）、纈沙坦 （北京諾華制藥公司饋贈），DMEM干粉培養基、胰蛋白酶、胎牛血清、TRIZOL（Gibco公司），3H-亮氨酸（中科院上海原子能研究所），RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司），PCR引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成，其余試劑為國內目前最優質的化學試劑；Dynatech MR580顯微ELISA讀數器 （Shimazu）；LS3810液體閃爍儀（Beckman公司）；基因擴增儀（Ferrotec公司）。

1.2 實驗分組 （1）對照組；（2）AngⅡ（10-6mol/L）組；（3）AngⅡ（10-6mol/L）＋三七總皂苷 （10-8g/L）組；（4）AngⅡ（10-6mol/L）＋纈沙坦（10-6mol/L）組；（5）三七總皂苷（10-8g/L）組；（6） 纈沙坦 （10-6mol/L）組。

1.3 新生大鼠原代心肌細胞培養 參照文獻[6]，在無菌條件下取出大鼠心室，在4℃ D-Hanks液中剪碎，用0.1%的胰蛋白酶消化成單細胞懸液。為了選擇性收集心肌細胞，加入20%的DMEM培養液在5%CO2，37℃培養箱中差速貼壁1～2h除去非心肌細胞，吸出未貼壁的心肌細胞稀釋成1×105/mL的濃度接種于6孔板，每孔2mL。在培養的前48h，加入0.1mmol/L 5-溴脫氧尿苷抑制非心肌細胞的增殖，然后換無血清培養液。

1.4 細胞毒性的測定 將心肌細胞置于96孔的微孔板培養，更換培養液后，將PBS中加上高濃度的三七總皂苷，孵育24h后，用 MTT 法檢測細胞毒性[3]，每孔（10μL/100μL 培養液）加入MTT溶液 （5mg/mL），在37℃中孵育4h，每孔加入酸-異丙醇（100μL,0.04mol/L的HCL于異丙醇中），徹底混勻至深藍色結晶溶解。在室溫下靜置幾分鐘（保證所有的晶體溶解）。然后把培養板置于Dynatech MR580顯微ELISA讀數器中讀數，選用570nm的測試波長和630nm的參照波長。

1.5 心肌細胞大小的測定 心肌細胞在無血清培養液中培養24h后，每24h按分組加藥1次，48h換液1次，加藥持續作用7d后，0.25%的胰酶消化使之脫落，在相差顯微鏡下用測微器測細胞直徑，每孔觀察10個視野，每個視野測10個細胞，取其平均值。

1.6 心肌細胞3H-亮氨酸摻入測定 心肌細胞在無血清培養液中培養24h后，加入AngⅡ、三七總皂苷、纈沙坦和18.3kBq 3H-亮氨酸繼續培養24h。棄培養液，PBS沖洗2遍，用0.25%胰蛋白酶消化后收集細胞于玻璃纖維素膜上，10%的三氯乙酸固定，濾膜烘干后用LS3810液體閃爍儀測定放射強度。

1.7 心肌細胞總RNA提取 收獲2×105個心肌細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA。每孔細胞加入Trizol試劑2mL，經氯仿和異丙醇抽提后，將所得的RNA溶于少量無Rnase水中，紫外分光光度計測定其濃度和純度，重復測定3次，計算樣品總RNA濃度：OD260∶280比值在1.8～2.0之間。

1.8 逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR） 采用 Yang等[4]設計的 c-fos 引物 （上游：5′-GGT CAT CGG GGA TCT TGC-3′，下游：5′-GGG CTC TCC TGT CAA C-3′），擴增片段長度為 510bp；內參 β-actin （上游：5′-CCT TCC TGG GCA TGG AGT CCT G-3′，下游 5′-GGA GCA ATG ATC TTG ATC TTC-3′），擴增片段長度為205bp。按照RT-PCR試劑盒的說明，進行目的基因擴增。 RT-PCR 條件為：（1）cDNA 合成和預變性 37℃ 60min，94℃5min；（2）PCR 擴增：94℃ 50s，57℃ 50s，72℃ 50s進行 30 次循環（c-fos擴增10個循環后，再加入內參引物進行余下的20個循環）。 （3）延伸：72℃ 5min。 取 RT-PCR 產物 5μL，加 2μL 上樣緩沖液，1.5%瓊脂糖凝膠 （含溴化乙錠0.5μg/μL）電泳 25min，用GDS8000凝膠成像分析系統（UVP）掃描定量，并計算與β-actin的比值。

2 結 果

2.1 三七總皂苷和纈沙坦對AngⅡ誘導的心肌細胞大小的影響 見表1。AngⅡ持續作用7d后，心肌細胞直徑明顯增大（P＜0.05）；三七總皂苷和纈沙坦均能抑制這種心肌細胞大小的改變（P＜0.05）。

表1 各組心肌細胞大小比較 （±s）

表1 各組心肌細胞大小比較 （±s）

與對照組比較，*P＜0.05。與AngⅡ組比較，△P＜0.05。

組 別對照組AngⅡ組AngⅡ+三七總皂苷組細胞直徑（μm）18.90±1.80 29.90±3.50*22.10±2.70*AngⅡ+纈沙坦組三七總皂苷組20.00±2.90*19.40±2.80纈沙坦組合成速率（cpm）1210±123 1908±104 1408±110△1368±108△1198±121 1215±12019.10±2.50

2.2 三七總皂苷和纈沙坦對心肌細胞蛋白質合成速率的影響AngⅡ作用24h后，心肌細胞合成速率AngⅡ組較對照組明顯增加（P＜0.01），三七總皂苷組和纈沙坦組對心肌細胞蛋白質合成沒有影響，但均能抑制AngⅡ刺激的心肌蛋白質合成速率的增加（P＜0.05）。

2.3 三七總皂苷和纈沙坦對原癌基因c-fos mRNA表達的影響在培養液中加入AngⅡ作用30min后，c-fos mRNA的表達顯著增強（P＜0.01），預先加入三七總皂苷或纈沙坦作用30min，可阻斷AngⅡ的作用（P＜0.01），而三七總皂苷和纈沙坦本身對原癌基因c-fos mRNA的表達無影響。見圖1。

圖1 三七總皂苷和纈沙坦對AngⅡ誘導的心肌細胞原癌基因c-fos mRNA表達的影響

3 討 論

許多刺激因子如機械牽張、AngⅡ、內皮素（ET-1）均可引起心肌肥厚[7]。為了探討三七總皂苷對心肌肥厚的作用，以上實驗研究了三七總皂苷對AngⅡ誘導的心肌細胞蛋白質合成速率及原癌基因c-fos mRNA表達的影響，發現三七總皂苷可以減少AngⅡ所致的心肌細胞細胞凋亡，從而抑制心肌細胞肥大，其效果與AT1受體拮抗劑相似。

大量研究表明，三七總皂苷是一選擇性的慢鈣通道阻滯劑[8-10]，AngⅡ使蛋白激酶C活性增加并伴隨胞漿內Ca2+濃度增高[11]，AngⅡ增加Ca2+依賴的內源性核酸酶的活性，導致DNA 斷裂[12]，從而導致心肌細胞凋亡。細胞內Ca2+升高被認為是導致細胞凋亡的最后通路，抑制細胞內Ca2+超載可降低細胞凋亡的發生。由此我們推測：三七總皂苷抑制AngⅡ誘導的心肌肥厚可能是通過降低心肌細胞Ca2+變化，阻斷MAPK和CaN途徑將肥大信號傳入核內，從而抑制立原癌基因c-fos mRNA的表達而實現的。

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