川芎嗪對缺血性腦損傷大鼠腦勻漿、血清中TNF-α、IL-10 水平的影響

王維和，趙敬富，張曙光，鞏同玉，劉 靜

(桓臺縣人民醫(yī)院，山東 桓臺 256400)

川穹嗪(TMP)具有活血化瘀的作用，其可通過血腦屏障，擴(kuò)張小動脈、改善微循環(huán)和增加腦血流量發(fā)揮腦保護(hù)作用。近期，我們觀察了TMP對缺血性腦損傷(HIBD)大鼠腦勻漿、血清TNF-α、IL-10的水平影響，探討其腦保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 成年Wistar大鼠135只，7周齡。由濱州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，本實(shí)驗(yàn)室合籠生產(chǎn);正常哺乳喂養(yǎng)，雌雄不限，體質(zhì)量(150±3.5)g。鹽酸TMP注射液(北京市永康藥業(yè)有限公司);大鼠TNF-α、IL-10 ELISA試劑盒(美國Biosource公司);Bcl-2抗體(北京中杉生物試劑有限公司);免疫組化SP試劑盒(美國ZYMED公司);高速低溫離心機(jī)(德國Hares公司);組織脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、組織切片機(jī)(德國Leica公司);全自動酶標(biāo)儀(美國Multiskan M.S公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備及干預(yù) 參照Rice等［1］方法。制作腦損傷模型:大鼠行乙醚麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上，頸前正中切口，分離右側(cè)頸總動脈并結(jié)扎。其中45只大鼠(對照組)縫合皮膚，另90只大鼠于半小時(shí)后放入2 L的缺氧密閉容器中，通8%O2與92%N2的混和氣體1 h，溫度(36.5 ±0.5)℃。制模成功(阻斷右側(cè)頸總動脈血流后立即出現(xiàn)左側(cè)肢體活動減少，在桌面爬行時(shí)向左轉(zhuǎn)圈，不符合上述標(biāo)準(zhǔn)者棄去不用)隨機(jī)分為TMP組和生理鹽水組各90只。TMP組腹腔注射TMP 30 mg/kg，生理鹽水組注射等量生理鹽水。模型制備完成后即刻(0 h)及12 h后各注射1次。

1.2.2 TNF-α、IL-10水平檢測 各組均于制模后0、6、12、24、48 h 各處死大鼠 9 只。乙醚麻醉，剖胸暴露心臟左心室，取血5 ml，置于預(yù)冷的EP管中靜置0.5 h，4℃條件3000 r/min 15 min離心取血清，冰箱-20℃保存。用眼科剪剪破右心耳，從左心室用生理鹽水將血液沖凈，剪開頸后部皮膚向上暴露至顱頂，2把眼科鑷由枕骨大孔處向兩側(cè)撥開顱骨，取出右腦放入EP離心管稱重，減除EP管重計(jì)算腦濕重，液氮保存;標(biāo)本置勻漿器內(nèi)加生理鹽水(按照W/V 為1∶2)，冰水中研磨勻漿約 10 min，移至 1.5 ml EP管中，4℃條件12000 r/min 15min離心取上清，-20℃保存。采用ELISA法檢測兩組血清和腦勻漿TNF-α、IL-10水平，用全自動酶標(biāo)儀于450 nm波長下測定吸光度OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS8.02統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α =0.05。

2 結(jié)果

各組不同時(shí)點(diǎn)TNF-α水平見表1;IL-10水平見表2。

3 討論

研究證實(shí)，神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)間有復(fù)雜的雙向調(diào)節(jié)作用。前者產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽等調(diào)節(jié)因子，對免疫系統(tǒng)發(fā)揮功能性調(diào)節(jié)作用，后者可分泌免疫調(diào)節(jié)因子如細(xì)胞因子等調(diào)節(jié)特定的神經(jīng)系統(tǒng)的功能。腦缺血后產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［2］，細(xì)胞因子表達(dá)，腦組織和血清中不同的炎癥因子表達(dá)有各自的動態(tài)變化規(guī)律。

表1 各組腦勻漿、血清TNF-α水平比較(n=9，OD值，)

表1 各組腦勻漿、血清TNF-α水平比較(n=9，OD值，)

注:與對照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P＜0.05;與生理鹽水組同時(shí)點(diǎn)比較，△P＜0.05

組別0 h 6 h 12 h 24 h 48 h TMP 組血清 8.90 ±0.45＊△ 10.38±0.54＊△ 12.81 ± 0.51＊△ 12.53±0.82＊△ 10.87±0.80＊△腦勻漿 165.34 ±4.59＊△ 218.29±5.50＊△ 238.14 ± 2.70＊△ 207.29±4.41＊△ 202.50±4.72＊△生理鹽水組血清 9.81 ±0.66* 12.49 ±0.82* 14.44 ± 0.88* 12.79 ±0.45* 11.56 ±0.48*腦勻漿 172.21 ±4.34* 253.04 ±3.84* 297.01 ±10.11* 267.01 ±2.78* 235.30 ±4.60*對照組血清 7.23 ±0.50 8.57 ±0.36 9.69 ± 0.60 8.05 ±0.28 9.40 ±0.41腦勻漿 146.02 ±3.50 160.45 ±2.74 172.53 ± 3.84 170.22±3.93 159.49 ±3.20

表2 各組腦勻漿、血清IL-10水平比較(n=9，OD值，)

表2 各組腦勻漿、血清IL-10水平比較(n=9，OD值，)

注:與對照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P＜0.05;與生理鹽水組同時(shí)點(diǎn)比較，△P＜0.05

組別0 h 6 h 12 h 24 h 48 h TMP 組血清 11.24 ±1.21＊△ 13.14 ±0.92＊△ 15.13 ±0.87＊△ 18.54 ±0.82＊△ 17.21 ±0.96＊△腦勻漿 94.29±1.66＊△ 93.51±3.17＊△ 120.81±4.18＊△ 153.77±4.28＊△ 161.60±2.74＊△生理鹽水組血清 16.13 ±1.27* 16.94 ±1.21* 20.27 ±1.15* 22.55 ±1.19* 18.37 ±1.09*腦勻漿 105.73 ±6.79* 129.60 ±7.20* 131.20 ±5.13* 169.21 ±7.55* 176.75 ±5.16*對照組血清 10.31 ±0.46 12.87 ±0.99 13.01 ±0.70 13.29 ±0.72 12.48 ±1.02腦勻漿 88.60 ±2.15 87.70 ±1.33 106.30 ±3.53 135.10 ±6.16 142.35 ±3.64

促炎癥細(xì)胞因子是啟動、誘導(dǎo)或者抑制體內(nèi)炎癥反應(yīng)的一組細(xì)胞因子，包括 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10等。TNF-α是一種作用廣泛的多功能細(xì)胞因子，主要由單核巨噬細(xì)胞合成、釋放。神經(jīng)系統(tǒng)中主要由膠質(zhì)細(xì)胞分泌，參與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)［3］。TNF-α可以損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞造成血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能損傷性改變，如壞死、脫落，細(xì)胞間隙增大等而使腦血流減少［4］。TNF-α可通過抗氧化途徑保護(hù)神經(jīng)元，增強(qiáng)神經(jīng)元在再灌注過程中抵抗氧自由基的損傷［5］。IL-10是一種具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，其可抑制許多促炎癥細(xì)胞因子的合成與分泌，如使IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM、CSF)減少，減輕炎癥反應(yīng)［6］。

TMP又稱四甲基吡嗪，其具有抗血小板聚集、擴(kuò)張小動脈、改善微循環(huán)和腦血流的作用。可用于閉塞性血管疾病、腦血栓形成、脈管炎、冠心病、心絞痛等。以往研究表明，TMP可能抑制組胺、5-羥色胺的合成或釋放，體外試驗(yàn)表明TMP能直接拮抗組胺、5-羥色胺所致的豚鼠離體回腸的收縮［7］。本研究TMP組、生理鹽水組各時(shí)點(diǎn)腦勻漿、血清中TNF-α、IL-10水平均高于對照組，TMP組各時(shí)點(diǎn)腦勻漿、血清中TNF-α、IL-10水平均低于生理鹽水組。提示TMP治療可減輕缺氧缺血腦損傷后大腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)，具有腦保護(hù)作用。

總之，TMP具有腦保護(hù)作用，其可能機(jī)制為降低腦勻漿及血清中IL-10、TNF-α水平。

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