巨細(xì)胞病毒感染對(duì)大鼠肝移植慢性排斥反應(yīng)的致病機(jī)制探討

陳海鳴，王 英，萬(wàn)仁華，鄒志森，單人鋒，高良輝*

(1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南昌 330006;2江西省電力職業(yè)技術(shù)學(xué)院)

肝臟移植是終末期肝病的惟一有效治療方法，慢性排斥反應(yīng)(CR)是移植肝功能喪失的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，巨細(xì)胞病毒(CMV)感染是CR發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一。2007年1月～2009年12月，我們觀察CMV感染的肝移植受體大鼠慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生情況及纖維增生因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)表達(dá)，初步探討CMV感染對(duì)慢性排斥反應(yīng)的致病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 CMV感染模型制作及干預(yù) 肝移植受體大鼠(為近交系DA雄性大鼠)84只，體質(zhì)量250～350 g，均在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)。按隨機(jī)化原則分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各42只，肝臟移植術(shù)后當(dāng)天至移植后30 d皮下注射CsA 1 mg/(kg·d)。實(shí)驗(yàn)組移植當(dāng)天腹腔注射人巨細(xì)胞病毒(HCMV，浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液病研究所饋贈(zèng)［1］)0.4 ml，對(duì)照組腹腔注射生理鹽水0.4 ml。兩組均于移植術(shù)后0、1、2 d肌肉注射氨芐青霉素200 mg/(kg·d)。

1.2 相關(guān)指標(biāo)觀察 兩組均于肝移植后1、6、10、20、30、60 d各處死6只大鼠，采集移植肝臟及血清觀察以下指標(biāo)。

1.2.1 肝組織病理學(xué)變化 取肝組織制作切片，常規(guī)HE染色、Masson三色染色，參考Gao等［2］方法觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.2.2 排斥反應(yīng)活動(dòng)指數(shù)(RAI) 對(duì)移植肝臟、膽管炎性損傷、阻塞性動(dòng)脈病變及纖維化按程度輕重計(jì)算RAI。①膽管炎性損傷:損傷為0分;少數(shù)膽管被炎癥細(xì)胞圍繞，上皮細(xì)胞有核/漿比例增加等輕度反應(yīng)為1分;多數(shù)或全部膽管有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞呈核多形性、極性改變，胞質(zhì)空泡化等退行性改變略多為2分;上述兩項(xiàng)伴有退行性變和局灶性管腔破壞明顯，或部分膽管結(jié)構(gòu)完全破壞為3分。②肝動(dòng)脈阻塞性病變:正常動(dòng)脈為0分;內(nèi)膜增生或細(xì)胞浸潤(rùn)、動(dòng)脈管腔縮小＜10%原管腔為1分;動(dòng)脈管壁增厚、10%≤管腔縮小＜50%為2分;動(dòng)脈因阻塞性動(dòng)脈病變或纖維化，動(dòng)脈管腔縮小≥50%原管腔或完全閉塞為3分。③肝纖維化:無(wú)纖維化為0分;匯管區(qū)纖維化，小葉間無(wú)纖維間隔形成為1分;匯管區(qū)纖維化，小葉間不完全的纖維間隔形成為2分;匯管區(qū)纖維化，小葉間完全的纖維間隔形成為3分;廣泛纖維化形成，彌散性肝硬化為4分。三項(xiàng)RAI相加為總RAI(ORAI)。

1.2.3 肝組織 TGF-β1、PDGF、bFGF mRNA 表達(dá)檢測(cè) 取冰凍肝組織30 mg。Trizol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，冰上行PCR反應(yīng)，凝膠電泳30 min，攝影，采用RT-PCR檢測(cè)各指標(biāo)mRNA表達(dá)情況。

1.2.4 血清 TGF-β1、PDGF、bFGF 表達(dá)檢測(cè) 取血清0.1 ml，采用雙抗體夾心ELISA法，按試劑盒說(shuō)明操作。

1.3 生存期 除處死大鼠外，對(duì)每組所剩6只，采用Kaplan-Meier法計(jì)算生存期。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，所得數(shù)據(jù)以表示，生存率比較以Kaplan-Meier法檢驗(yàn)，組間比較用單因素方差分析One-way ANOVA，選擇LSD或Bonfferroni/Dunne t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)變化 兩組均顯示移植肝進(jìn)行性加重的慢性排斥反應(yīng)，表現(xiàn)為中度到重度的泡沫細(xì)胞阻塞性動(dòng)脈病變、膽管損傷或消失、細(xì)胞浸潤(rùn)和肝纖維化。取材時(shí)間越接近臨終期，病變特點(diǎn)越典型。

2.2 RAI ①膽管炎性損傷:肝移植后20 d內(nèi)兩組RAI無(wú)顯著差異;實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組移植后30 d RAI分別為2.17 ±0.98、1.33 ±0.52，P ＜0.01。即實(shí)驗(yàn)組膽管損傷發(fā)生早于對(duì)照組。②肝動(dòng)脈阻塞性病變:肝移植后20 d內(nèi)兩組無(wú)顯著差別。移植30 d對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組 RAI分別為 1.33±0.52和 2.50±0.55，P ＜0.01。但對(duì)照組30 d、實(shí)驗(yàn)組20 d 和對(duì)照組60 d、實(shí)驗(yàn)組30 d相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組動(dòng)脈阻塞性病變出現(xiàn)的時(shí)間早。③肝臟纖維化:對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組肝移植后20 d肝纖維化RAI分別為1.0 ±0.63、1.67 ±0.52，P ＜0.05;30 d 分別為2.67 ±0.52、3.17 ±0.75，P ＜0.05;即實(shí)驗(yàn)組肝纖維化明顯重于對(duì)照組。兩組不同時(shí)點(diǎn)ORAI見(jiàn)表1。

表1 兩組不同時(shí)間總排斥反應(yīng)活動(dòng)指數(shù)比較()

表1 兩組不同時(shí)間總排斥反應(yīng)活動(dòng)指數(shù)比較()

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.01

組別10 d 20 d 30 d實(shí)驗(yàn)組 2.83 ±1.33 5.17 ±1.47* 7.17 ±1.47*對(duì)照組3.00 ±1.33 8.00 ±1.67 10.83 ±2.32

2.3 移植肝 TGF-β1、PDGF、bFGF mRNA 表達(dá) 見(jiàn)圖1。

2.4 外周血 TGF-β1、PDGF、bFGF表達(dá) 見(jiàn)圖2。

圖1 兩組肝組織TGF-β1、PDGF、bFGF mRNA表達(dá)

圖2 兩組血清TGF-β1、PDGF、bFGF表達(dá)

2.5 生存期比較 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組生存期分別為(41.13 ±12.45)、(58 ±14.93)d，兩組比較 P ＞0.05。

3 討論

據(jù)報(bào)道，肝臟移植后HCMV的感染率為30% ～65%，可引起膽管消失，膽管萎縮及動(dòng)脈阻塞性病變。其中18%～40%的患者出現(xiàn)臨床癥狀，發(fā)病高峰期為移植后第1～3個(gè)月。有關(guān)HCMV感染與肝臟移植慢性排斥反應(yīng)的關(guān)系目前尚無(wú)明確定論。Lautenschlager等［3］報(bào)道，10例肝臟移植后因慢性排斥反應(yīng)導(dǎo)致移植物無(wú)功能者均有HCMV感染史;原位雜交檢測(cè)所有移植物持續(xù)表達(dá)CMV-DNA，在剩余的膽管中有強(qiáng)表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞中有中等程度的表達(dá)。Arnold等研究證實(shí)，膽管消失綜合征與持續(xù)HCMV感染有關(guān)。說(shuō)明HCMV感染是慢性排斥反應(yīng)的危險(xiǎn)因子之一。本研究?jī)山M生存期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但實(shí)驗(yàn)組移植后20、30 d總RAI均顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明HCMV感染加劇了慢性排斥反應(yīng)的程度，加速了其進(jìn)程。組織病理學(xué)半定量分析進(jìn)一步支持該結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組膽管損傷的出現(xiàn)顯著早于對(duì)照組，動(dòng)脈阻塞性病變明顯重于和早于對(duì)照組，肝臟纖維化程度亦呈現(xiàn)同樣趨勢(shì)。

Michelson等［4］發(fā)現(xiàn)，HCMV 的 IE 蛋白可激活TGF-β1啟動(dòng)子，5 ～9 h 后 TGF-β1基因轉(zhuǎn)錄激活，導(dǎo)致HCMV感染早期TGF-β1mRNA水平升高。本研究實(shí)驗(yàn)組肝組織及血清TGF-β1表達(dá)水平均無(wú)明顯升高，且與對(duì)照組無(wú)明顯差異，說(shuō)明HCMV感染加劇和加速慢性排斥反應(yīng)時(shí)纖維化程度與TGF-β1表達(dá)水平無(wú)關(guān)。

PDGF是有絲分裂促進(jìn)劑，能使間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞，促使平滑肌細(xì)胞遷移與增生導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、血管狹窄和慢性排斥;PDGF及其受體在心臟、腎臟和肺慢性排斥反應(yīng)的血管病變中起關(guān)鍵作用［5～7］。本研究顯示，慢性排斥反應(yīng)時(shí)發(fā)生早期(10 d以內(nèi))實(shí)驗(yàn)組肝組織及血清PDFG表達(dá)升高，6～20 d時(shí)均明顯高于對(duì)照組;慢性排斥反應(yīng)晚期(60 d)兩組PDFG表達(dá)無(wú)明顯差異，提示PDFG表達(dá)升高可能參與了早期慢性排斥反應(yīng)的形成。

bFGF是一多效細(xì)胞因子，在組織修復(fù)中起重要作用，可刺激血管平滑肌細(xì)胞增生、血管新生、細(xì)胞外基質(zhì)積聚和神經(jīng)元增生。Garrett等體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HCMV在成纖維細(xì)胞中培養(yǎng)可使bFGF的表達(dá)轉(zhuǎn)向高相對(duì)分子質(zhì)量形式。Koskinen等發(fā)現(xiàn)，在大鼠心臟慢性排斥反應(yīng)中，bFGF表達(dá)增多、炎癥反應(yīng)加重，導(dǎo)致血管新生和纖維化。本研究顯示，慢性排斥反應(yīng)時(shí)肝組織和血清bFGF均呈持續(xù)上升表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組bFGF mRNA表達(dá)水平自20 d開(kāi)始明顯高于對(duì)照組，提示HCMV感染可增加bFGF mRNA表達(dá)水平，加速移植肝纖維化和慢性排斥反應(yīng)進(jìn)程。

總之，CMV感染能加劇慢性排斥反應(yīng)泡沫細(xì)胞阻塞性動(dòng)脈病變和肝臟纖維化病變的程度，加快慢性排斥反應(yīng)的進(jìn)程，其致病機(jī)制可能與增加PDGF和bFGF表達(dá)相關(guān)。

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