貝甲抗癌湯含藥血清對肝癌細胞HepG2增殖和凋亡的影響

李 娜，張雯雯

(1山東大學附屬省立醫院，濟南 250021;2山東大學醫學院)

貝甲抗癌湯為中藥復方湯劑，臨床已應用多年，證實其對肝癌有一定的治療效果。2009年11月～2010年10月，我們觀察了中藥貝甲抗癌湯含藥血清(以下簡稱含藥血清)對肝癌細胞HepG2增殖和凋亡的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 腫瘤細胞株:人肝癌細胞株HepG2(山東大學細胞生物研究所)。昆明小鼠60只，雌雄各半，體質量32～38 g(山東大學實驗動物中心)。含藥血清:根據參考文獻［1］制備。主要試劑:DMEM培養基、胎牛血清(FBS，Gibco公司)，0.25%胰酶、吖啶橙(AO)、MTT(Sigma公司)，二甲基亞砜(DMSO，Hepes公司);主要儀器:超凈工作臺(DL-CJ-2ND，北京東聯哈爾儀器制造有限公司)，二氧化碳培養箱(Thermo公司)，倒置顯微鏡(Nikon公司)，酶聯免疫檢測儀(Thermo公司)，熒光顯微鏡(Olimpus公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及分組 HepG2細胞以適量濃度接種于10 cm培養皿中，加入含10%FBS、100 μg/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基中，置于37℃恒溫、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養。細胞貼壁生長2～3 d于倒置相差顯微鏡下觀察細胞鋪滿約80%傳代。傳代時吸出培養液，PBS洗1次，胰酶消化，加入新鮮的培養液吹打均勻，調整細胞至適當濃度移入新的培養皿中，添加培養液至適量。取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 細胞干預及增殖抑制率測定 根據參考文獻［2］制取低濃度、高濃度含藥血清。取對數生長期細胞臺盼藍染色。用含10%FBS的DMEM培養液調整細胞濃度至104/ml接種至96孔細胞培養板，100 μl/孔(空白孔只加入細胞培養液 100 μl/孔)，每組設6個平行孔。放入37℃恒溫、5%CO2、飽和濕度培養箱培養24 h使細胞貼壁，吸出培養液后分為三組，實驗1組、實驗2組分別加入低濃度、高濃度含藥血清配置的 DMEM培養液100 μl/孔，對照組加入普通DMEM培養液100 μl/孔，空白孔加入普通 DMEM培養液100 μl/孔。培養箱避光培養24、48、72 h 后吸出培養液，加入 1 mg/ml MTT 100 μl/孔，繼續培養4 h。4 h后吸出MTT，加入DMSO 150 μl/孔，微量震蕩器震蕩5 min，使其中的藍色顆粒充分溶解。將培養板放入酶標儀，測定570 nm處吸光度值(OD值)。細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.3 細胞干預及凋亡率測定 以5×104/ml的濃度接種對數生長期細胞于放置蓋玻片的6孔培養板中，每孔2 ml。24 h后吸棄培養液細胞分為三組。實驗1組、實驗2組分別加入低濃度、高濃度含藥血清配置的DMEM培養液2 ml/孔，對照組加入普通DMEM培養液2 ml/孔。繼續培養48 h和72 h，細胞飛片TBS洗5 min，95%乙醇固定5 min。0.01%AO避光染色5 min。熒光顯微鏡下觀察10個隨機視野，計數凋亡細胞。細胞凋亡率=(凋亡細胞/總細胞數)×100%。

1.3 統計學方法 采用SPSS11.0軟件，應用 t檢驗，計量數據以表示。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 細胞增殖抑制率 見表1。由表1可見，實驗1組、實驗2組隨作用時間延長，其增殖抑制率逐漸增加，P均＜0.01;實驗1組、實驗2組間各時點增殖抑制率比較無統計學差異。

表1 各組不同時點細胞增殖抑制率比較(%，)

表1 各組不同時點細胞增殖抑制率比較(%，)

組別24 h 48 h 72 h實驗1組13.30 ±1.20 38.61 ±1.43 44.98 ±3.16實驗2 組 19.48 ±2.31 36.44 ±1.89 49.00 ±2.32對照組---

2.2 細胞凋亡率 見表2。

表2 各組不同時點細胞凋亡率比較(%，)

表2 各組不同時點細胞凋亡率比較(%，)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

組別24 h 48 h 72 h實驗1 組 7.40 ±1.28* 17.62 ±2.51* 30.74 ±1.32*實驗2 組 5.25 ±0.49* 14.00 ±1.21* 28.57 ±2.44*對照組1.52 ±0.83 1.34 ±0.11 2.94 ±0.47

3 討論

細胞凋亡亦稱程序性細胞死亡，不僅對胚胎發生、個體發育和保持機體穩定等生物學功能至關重要，而且在調控細胞增殖、腫瘤形成和發展中起關鍵作用。凋亡過程的紊亂可促進腫瘤的發生與惡化。研究表明，誘導腫瘤細胞凋亡是眾多腫瘤治療方法(如放療、化療、生物治療等)的重要藥理學機制和生物學效應之一［2］。

中醫中藥治療腫瘤具有獨特的優勢。復方中藥成分多樣，通過多靶點綜合作用以達到抗癌效應，且對正常組織傷害小。研究發現，部分傳統中草藥有確鑿的抗腫瘤作用［3］:蟾酥提取物通過下調凋亡相關基因c-myc等表達而誘導HL-60、ML-1細胞凋亡［4］;柑橘素通過下調Akt和Caspase-3的活性誘導人白血病THP-1細胞凋亡［5］;三七總皂甙在防治結直腸癌中有確切療效［6］。但絕大多數復方中藥(如本方)成分復雜，用藥周期較長，確切的抗癌機制尚不完全明確。對中藥有效成分和其作用機理的研究是今后工作的重點。貝甲抗癌湯由柴胡、土茯苓、浙貝、炒白術、莪術、薏米、炮山甲、甘草等組成，經水泡煮沸、去藥渣，最終生藥濃度0.25 g/ml。本研究結果顯示，實驗1組、實驗2組隨作用時間延長，增殖抑制率逐漸增加;但兩組各時點增殖抑制率無統計學差異;實驗1組、實驗2組各時點凋亡率均明顯高于對照組，但兩組間比較無統計學差異。提示含藥血清可誘導HepG2細胞凋亡，且藥物的時間—效應關系較明確，即隨著含藥血清作用時間的延長(24～72 h)細胞凋亡明顯增加;而劑量—效應關系不明顯，可能與藥物體內代謝造成有效代謝產物在血清中含量變化(即含藥血清濃度)有關。

綜上所述，含藥血清體外對抑制肝癌細胞生長、促進肝癌細胞凋亡的作用較明顯。本研究為含藥血清用于肝癌的治療提供了實驗依據。

［1］Rockmann H，Schadendorf D.Drug resistance in human melanoma:mechanisms and therapeutic opportunities［J］.Onkologie，2003，26(6):581-587.

［2］謝長生，高文倉，陳陪豐，等.養陰清熱方對615小鼠HCa-F肝癌凋亡相關蛋白 Bcl-2、Bax表達的影響［J］.中華中醫藥學刊，2007，25(11):2327-2329.

［3］Efferth T，Kahl S，Paulus K，et al.Phytochemistry and pharmacogenomics of natural products derived from traditional Chinese medicine and Chinese materia medica with activity against tumor cells［J］.Mol Cancer Ther，2008，7(1):152-161.

［4］Masuda Y，Kawazoe N，Nakajo S，et al.Bufalin induces apoptosis and influences the expression of apoptosis-related genes in human leukemia cells［J］.Leukermia Research，1995，19(8):549-556.

［5］Park JH，Jin CY，Lee BK，et al.Naringenin induces apoptosis through downregulation of Akt and Caspase-3 activation in human leukemia THP-1 cells［J］.Food Chem Toxicol，2008，46(12):3684-3690.

［6］Wang CZ，Xie JT，Zhang B，et al.Chemopreventive effects of panax notoginseng and its major constituents on SW480 human colorectal cancer cells［J］.Int J Oncol，2007，(31):1149-1156.