Livin在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中的表達及臨床意義

張 萌，袁乃芬，劉 巍

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊 050011)

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)是兒童常見的眼內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅患兒的視力和生命。凋亡抑制蛋白(Livin)是2000年由科學(xué)家在人基因組庫中篩選克隆出的一種新型、有較強抗凋亡功能的凋亡抑制蛋白(IAPs)家族新成員，能夠與凋亡蛋白酶結(jié)合，抑制其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［1，2］。2000年1月 ～2010年12月，我們采用Max-VisionTM快捷免疫組化法檢測RB中Livin的表達情況，旨在進一步了解其在RB發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇我院手術(shù)切除的RB組織標(biāo)本43份(腫瘤組)，其中男23例，女20例;年齡9個月～8歲，平均3.35歲。所有患兒均經(jīng)病理證實，且術(shù)前均未進行放化療。按傳統(tǒng)臨床分期，眼內(nèi)生長期21例，青光眼期13例，眼外擴展期9例;按照組織病理學(xué)分型，未分化型24例，分化型19例。另選外傷后眼球摘除的正常組織標(biāo)本6份(正常組)，兩組一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異。主要試劑:兔抗人Livin多克隆抗體購自北京博奧森公司(bs-0738R)。主要儀器:Leica RM2135型切片機、Olympus BX41顯微鏡、Qcapture圖像采集系統(tǒng)(加拿大Qimaging公司)。

1.2 Livin表達檢測 所有標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定，自動脫水，浸蠟，包埋，切片。蘇木素—伊紅(HE)染色按常規(guī)進行。免疫組化采用Max-VisionTM快捷免疫組化法。石蠟切片脫蠟和水化后，PBS(pH 7.4)沖洗3次，抗原修復(fù)后，3%過氧化氫室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性，PBS沖洗3次，加入工作濃度1∶300的Livin抗體室溫孵育2～3 h，PBS沖洗3次，加入二抗，室溫下孵育20 min，PBS沖洗，最后DAB顯色，中止反應(yīng)后蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。以已知的陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。陽性判定標(biāo)準(zhǔn):Livin表達主要位于細(xì)胞質(zhì)，以出現(xiàn)清晰的棕黃色顆粒作為陽性結(jié)果判定。每張切片隨機選取10個不同高倍視野各計數(shù)100個細(xì)胞，按陽性細(xì)胞所占的百分比計分:≤5%計0分，6% ～25%計1分，26% ～50%計2分，51% ～75%計3分，＞75%計4分;著色強度依據(jù)著色計分:無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深棕褐色為3分。上述兩項相加＜2分為陰性，＞2分為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Livin表達情況 兩組Livin陽性表達率分別為62.79%、0，P ＜0.05。

2.2 Livin表達與RB臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 Livin表達與RB臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

惡性腫瘤的發(fā)生不僅與癌基因的激活和抑癌基因的突變或缺失有關(guān)，還與腫瘤凋亡的抑制有關(guān)。凋亡抑制是腫瘤細(xì)胞的一個重要特性，與腫瘤細(xì)胞無限增殖密切相關(guān)。IAPs是目前發(fā)現(xiàn)的惟一可以與半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase)直接結(jié)合而起抑制作用的蛋白家族，其過度表達引起的凋亡不足與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。Livin又名KIAP/ML-IAP，2000年在人基因組庫中篩選克隆出的一種新型、有較強抗凋亡功能的IAPs蛋白家族新成員。Livin基因定位于染色體20q13，全長4.6 kb，包含7個外顯子及6個內(nèi)含子，其基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有兩種mRNA亞型，分別編碼298個氨基酸蛋白質(zhì)(α)和280個氨基酸蛋白質(zhì)(β)，Livin蛋白N端包含1個BIR結(jié)構(gòu)，C端含1個 RING環(huán)指結(jié)構(gòu)［3］。研究發(fā)現(xiàn)，Livin在黑色素瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌和膀胱癌等腫瘤細(xì)胞中及胎盤、胚胎組織中表達，但在多數(shù)正常成人組織中不表達。這一表達的特異性使Livin基因成為目前國際研究的熱點［4］。

Livin的高表達可能與腫瘤的形成和細(xì)胞增殖活躍密切相關(guān)［5］。本研究腫瘤組Livin陽性表達率明顯高于正常組，提示Livin的高表達可能與RB的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)Livin陽性表達與RB的組織分化程度有關(guān)，提示Livin的陽性表達不但與RB的發(fā)生有關(guān)，還可能與RB的惡性程度呈正相關(guān)，可能是預(yù)后不良的指征?？赡軝C制:Livin的BIR區(qū)與Caspase結(jié)合，抑制Caspase活性，尤其是抑制 Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9的活性，從而阻斷凋亡受體及以線粒體為基礎(chǔ)的凋亡途徑［6，7］。本研究還發(fā)現(xiàn)Livin陽性表達與RB臨床分期無明顯相關(guān)性，表明Livin表達可能與腫瘤的局部浸潤生長無明顯相關(guān)性，也可能因為本研究病例數(shù)較少，有待于大樣本的研究做進一步評價。

總之，Livin表達上調(diào)在RB的發(fā)生、發(fā)展中起促進作用，可作為RB早期診斷及預(yù)后的指標(biāo)之一，為RB的基因治療提供新靶點。

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［4］Gazzaniga P，Gradilone A，Giuliani L，et al.Expression and prognostic significance of livin，survivin and other apoptosis related genes in the progression of superficial bladder cancer［J］.Ann Oncol，2003，14(1):85-90.

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