華蟾素對肝癌細胞株SMMC-7721增殖、凋亡的影響

鄭培實，張 陽，蔣 葵，戴朝霞，徐麗葉，方立萍，丁曉蕾

(大連醫科大學附屬第二醫院，遼寧 大連 116027)

肝癌是常見惡性腫瘤，近年來病死率呈逐年上升趨勢，對于晚期肝癌，缺少有效的藥物治療方案［1］。2010年3～10月，我們觀察了華蟾素對離體肝癌細胞株SMMC-7721增殖、凋亡的影響，旨在為肝癌的臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌SMMC-7721細胞株(中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫);華蟾素注射劑(安徽金蟾制藥廠);Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物發展有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 培養環境為37℃、5%CO2孵箱，使用10%胎牛血清(57℃滅活30 min)、青鏈霉素各100 U/ml的RPMI1640培養液。細胞為上皮樣貼壁細胞，每3 d傳代1次，取對數生長期的細胞用于試驗。

1.2.2 華蟾素干預及細胞增殖抑制率檢測 取對數生長期SMMC-7721細胞接種于96孔板，密度為7×103/孔，培養24 h。實驗組分別加入0.4、0.6、0.8 μmol/L華蟾素，每藥物濃度各設5個復孔，對照組不加藥。加藥后分別培養24、48 h后，各孔加5%四氮唑藍液10 μl，孵育4 h，洗滌后各孔加二甲亞砜200 μl，充分混勻溶解，酶標儀測定570 nm波長處各孔的D值，計算細胞增殖抑制率。抑制率(%)=(對照組D570值 -實驗組 D570值)/對照組 D570值 ×100%。

1.2.3 華蟾素干預及細胞凋亡率檢測 取對數生長期的SMMC-7721細胞接種于6孔板，培養24 h后實驗組加入華蟾素，使其終濃度為0.6 μmol/L，對照組不加藥。離心去培養基，PBS洗滌后，采用Annexin V-FITV/PI雙標記的流式細胞術避光室溫標記30 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 華蟾素干預及細胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3 mRNA檢測 分組及干預同1.2.3，藥物作用48 h后收集5×106/ml細胞于離心管中，離心去上清液;加入Trizol試劑，按說明書操作步驟提取RNA。采用RT-PCR法(凱基公司的RT-PCR反應體系)檢測Caspase-3 mRNA相對表達量。

1.2.5 華蟾素干預及測Mcl-1蛋白檢測 采用Western blot法。分組及干預同1.2.3。藥物作用48 h后收集細胞提取總蛋白。以tubulin為內參照，結果用Leica Qwin圖像分析軟件分析條帶光密度積分值。

1.3 統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 細胞增殖抑制率 見表1。

表1 兩組細胞增殖抑制率比較(%)

2.2 細胞周期及凋亡率 見表2。

表2 兩組細胞周期所占比例及凋亡率比較(%，)

表2 兩組細胞周期所占比例及凋亡率比較(%，)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

組別 G0～G1期 G2～M期 S 期 凋亡率實驗組 55.53 ±0.75 1.32 ±0.19 41.54 ±0.5417.26 ±0.89*對照組63.21 ±1.2410.21 ±0.13 24.33 ±1.453.21 ±0.43

2.3 Caspase-3 mRNA及Mcl-1蛋白表達 華蟾素作用48 h后，實驗組Caspase-3 mRNA分別為(0.54±0.10)%、(0.32 ±0.11)%，P ＜0.05;Mcl-1 蛋白分別為(0.60 ±0.14)%、(0.95 ±0.11)%，P ＜0.05。

3 討論

蟾蜍治療腫瘤有著悠久的歷史和豐富的文獻記載，目前用于多種腫瘤［2，3］，有研究提示其可能通過干預FAS通路發揮抗腫瘤作用［4］。但其在Mcl-1為中心的凋亡通路中發揮的作用尚不明確。本研究實驗組增殖抑制率明顯高于對照組，且呈時間和劑量依賴性，提示華蟾素作用于SMMC-7721離體細胞，可抑制其增殖，并且誘導其凋亡。

Caspase是一個含有半胱氨酸活性的胞質蛋白酶家族，迄今至少發現14個成員。Caspase-3是目前發現的細胞凋亡過程中激活的關鍵酶，也是細胞凋亡的主要效應分子［5］。其作用之一是參與Mcl-1蛋白的降解［6，7］，而后者通過特定信號通路抑制細胞凋亡、調節細胞周期，其過表達可以促進惡性腫瘤細胞生存，可引起在人類的造血系統的腫瘤以及多種實體瘤，其亦是腫瘤對傳統的治療耐藥的一個關鍵因素。Mcl-1即髓系白血病基因，在細胞的生長和分化過程中是一個必要的抗凋亡因子，調節其表達的信號傳導通路中的任何一個環節出現調節紊亂都會引起Mcl-1的過度表達，從而導致包括腫瘤在內人類一些疾病的發生。Mcl-1過表達可引起包括肝癌在內的多種實體瘤［8］，并且是腫瘤對傳統的治療耐藥的一個關鍵因素［9］。

本研究實驗組Caspase-3 mRNA表達量明顯高于對照組，Mcl-1蛋白表達量明顯低于對照組，說明華蟾素對SMMC-7721離體肝癌細胞具有增殖抑制及凋亡誘導作用，其機理可能為使Caspase-3表達升高、Mcl-1表達降低。本研究為華蟾素治療肝癌提供了更深入的理論依據。

［1］Wang JH，Changchien CS，Hu TH，et al.The efficacy of treatment schedules according to Barcelona Clinic Liver Cancer staging for hepatocellular carcinoma-Survival analysis of 3892 patients［J］.Eur J Cancer，2008，44(7):1000-1006.

［2］王焰，李軍民，楊晨敏，等.華蟾素誘導NB4細胞凋亡及其作用機制［J］.腫瘤，2005，25(6):534-537.

［3］張靜.華蟾素聯合化療治療晚期惡性腫瘤的療效分析［J］.腫瘤，2000，20(5):379-381.

［4］張莉.華蟾素誘導 U937細胞凋亡及其作用機制［J］.腫瘤，2007，27(5):341-344.

［5］王新艷，李玉華，朱謚豢，等.卵巢癌組織KLKⅡ基因的表達意義［J］.第四軍醫大學學報，2006，27(22):2023-2025.

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［8］Derenne S，Monia B.Antisense strategy shows that Mcl-1 rather than Bcl-2 or Bcl-x(L)is an essential survival protein of human myeloma cells［J］.Blood，2002，100(1):194.

［9］Hussain SA，Cheney CM.Mcl-1 is a relevant therapeutic target in acute and chronic lymphoid malignancies:down-regulation enhances rituximab mediated apoptosis and complement-dependent cytotoxicity［J］.Clin Cancer Res，2007，13(7):2144.