乳腺癌組織中 FOXO3a、β-Catenin、PCNA 的表達及臨床意義

徐駿飛，江 穎，倪啟超，何志賢，汪 濤，徐 青，3*

(1南通大學附屬醫院，南通大學醫學院，江蘇 南通 226001;2復旦大學附屬中山醫院;3中國康復研究中心)

近年來，乳腺癌在我國的發病率和病死率迅速上升，已成為威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一。2009年12月～2010年9月，我們采用免疫組化En vision兩步法檢測了乳腺癌組織中叉頭轉錄因子(FOXO3a)、β-連環素(β-Catenin)、增殖細胞核抗原(PCNA)的表達，旨在進一步探討乳腺癌的發生、發展機制。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇我院手術切除的乳腺癌組織標本68份(腫瘤組)，患者均為女性，年齡29～86歲，中位年齡48歲;年齡≤50歲45例，＞50歲23例。所有患者均經病理證實，且術前均未行化療。按照2006年WHO乳腺腫瘤組織學分類Ⅰ級22例，Ⅱ級35例，Ⅲ級11例;腫瘤直徑≤2.0 cm 22例，＞2.0 cm 46例;腋窩淋巴結轉移陽性28例;雌激素受體(ER)陽性34例;PR陽性24例;HER2-～+33例，++～+++35例;采用國際抗癌協會(UICC)TNM分期法Ⅰ級15例，Ⅱ級35例，Ⅲ級18例;術后死亡12例(中位生存時間4年4月)。另選同期保存的20份乳腺纖維腺瘤組織標本(腺瘤組)作對照，兩組一般資料無統計學差異。主要試劑:兔抗人FOXO3a(75D8)、兔抗人 β-Catenin(Cell Signal公司)，鼠抗人PCNA(PC10):sc-56(Santa Cruz公司)，HRP標記的山羊抗小鼠IgG、HRP標記的山羊抗兔IgG(Sigma 公司)，檸檬酸抗原修復液(pH 6.0，0.01 mol/L)及DAB顯色劑(北京中杉生物技術有限公司)。

1.2 FOXO3a、β-Catenin、PCNA 表達檢測 采用Envision兩步法。所有標本均經石蠟包埋，組織5 μm連續切片，常規脫蠟至水，0.3%H2O2-甲醇溶液37℃ 30 min，檸檬酸緩沖液高壓抗原修復3 min，5%二抗正常血清室溫封閉2 h，一抗室溫孵育1 h后4℃過夜。FOXO3a、β-Catenin和 PCNA抗體的工作稀釋度均為1∶100，DAB顯色，蘇木精對比染色。采用已知的免疫組化染色陽性標本作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。結果判斷:光鏡下每張切片選取5個有代表性的高倍視野(×400)，每個視野隨機計數300個腫瘤細胞，共計1500個，計算陽性細胞百分率，按陽性細胞所占比例分級。FOXO3a和PCNA蛋白表達主要定位于細胞核，以出現棕黃色顆粒為陽性細胞，陽性細胞百分數＜10%為陰性，≥10%為陽性。β-Catenin表達主要定位于細胞膜，細胞膜呈棕褐色細小顆粒狀著色為陽性。根據文獻將染色計為0～3分。0分:細胞膜、質均未染色“-”;1分:細胞質染色為主“+”;2分:異質性染色(細胞膜、細胞質、細胞核混合染色)“++”;3分:連續的細胞膜染色“+++”。0、1和2分者均為異常表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS15.0、Stata7.0統計軟件。各組數據間比較采用χ2檢驗，各指標間相互關系比較用Spearman等級相關分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 FOXO3a、β-Catenin、PCNA 表達 腫瘤組、腺瘤組 FOXO3a陽性表達率分別為60%、90%，β-Catenin異常表達率分別為65%、25%，PCNA陽性表達率分別為69%、35%，P均＜0.05。

2.2 FOXO3a、β-Catenin、PCNA 表達與乳腺癌臨床病理參數的關系 見表1。

表1 FOXO3a、β-Catenin、PCNA蛋白表達與乳腺癌臨床病理參數的關系

2.3 相關性分析 乳腺癌組織中FOXO3a陽性表達與β-Catenin異常表達、PCNA陽性表達均呈負相關(r分別為 -0.145、-0.173，P 均 ＜ 0.05)，β-Catenin異常表達與PCNA陽性表達呈正相關(r=0.04，P ＜0.05)。

3 討論

乳腺癌是發達國家中致死率較高的腫瘤性疾病，其發生發展是多基因多因素共同作用的結果。轉錄因子FOXO3a是發育調節轉錄因子叉頭基因家族中的一員，是PI3K-Akt信號通路中起關鍵作用的重要因素之一，其含有一個高度保守的DNA結構域，由100個含有特征性α螺旋、β鏈及環1和C末端［1～3］保守的氨基酸殘基組成。其定位于6號染色體，并編碼673個氨基酸。研究發現，FOXO3a在細胞的增生、轉化、分化、衰老等過程中發揮重要的調控作用;在多種癌組織中表達［4］。Jin等［5］發現，FOXO3a蛋白在乳腺腫瘤不同組織學類型中表達，良性腫瘤中絕大多數FOXO3a廣泛存在于細胞質中，且處于非活性狀態。而在惡性乳腺中，大多數表達以活化形式存在于細胞核中。本研究腫瘤組FOXO3a陽性表達率明顯低于腺瘤組，提示FOXO3a的表達失活可能與乳腺癌的發生相關。FOXO3a陽性表達與乳腺癌腋窩淋巴結轉移、ER、臨床分期、預后相關，提示隨著乳腺癌的進展，FOXO3a表達率降低。FOXO3a可能不僅與乳腺癌的發生相關，且與乳腺癌的進展密切相關。

目前研究證明，癌基因的致癌作用及抑癌基因的抑癌作用是多個基因共同作用的結果。β-Catenin是一胞質蛋白，除參與細胞間黏附過程中鈣黏著蛋白與細胞骨架的肌動蛋白黏附，在Wnt通路中發揮比較關鍵的作用。致癌的關鍵是β-Catenin降解障礙致使胞質內游離的β-Catenin聚集并與Tcf/Lef結合進入細胞核，激活下游靶基因CyclinD1、C-myc的轉錄，導致腫瘤的發生。正常乳腺組織中β-Catenin主要表達于細胞膜，在細胞質和細胞核中幾乎不著色，而乳腺癌組織中則相反，主要在細胞質或細胞核內聚集表達［6，7］。本研究腫瘤組 β-Catenin 異常表達率明顯高于腺瘤組，提示β-Catenin的高表達在乳腺癌的發生中可能起重要作用。β-Catenin異常表達與乳腺癌組織學分級、腋窩淋巴結轉移、臨床分期相關，提示其高表達可能在乳腺癌的惡性程度和轉移性有密切關系。

PCNA 是瘤細胞增生活躍的指標［8，9］，是判斷乳腺癌預后的有效標記物。PCNA的表達與瘤細胞的生物學行為密切相關，陽性表達者特別是陽性強度越高時預后較差。本研究腫瘤組PCNA陽性表達率明顯高于腺瘤組，提示PCNA在惡性組織中的表達明顯高于良性組織。PCNA陽性表達與乳腺癌腋窩淋巴結轉移、臨床分期相關，提示PCNA高表達增加了瘤細胞轉移的危險性。本研究還發現，乳腺癌組織中FOXO3a陽性表達與β-Catenin異常表達、PCNA陽性表達均呈負相關，β-Catenin異常表達與PCNA陽性表達呈正相關。說明 β-Catenin、PCNA可能作為FOXO3a作用途徑中的相關基因，相互作用共同參與乳腺癌的發生過程。但FOXO3a與β-Catenin、PCNA基因的相互作用機制尚待進一步研究。

［1］Tsai KL，Huang CY，Chang CH，et al.Crystal structure of the human FOXK1a-DNA complex and its implications on the diverse binding specificity of winged helix/fork head proteins［J］.J Biol Chem，2006，281(25):17400-17409.

［2］Stroud JC，Wu YM，Bates DL，et al.Structure of the forkhead domain of FOXP2 bound to DNA［J］.Structure，2006，14(1):159-166.

［3］Weigelt J，Climent I，Dahlman-Wright K，et al.Solution structure of the DNA binding domain of the human forkhead transcription factor AFX(FOXO4)［J］.Biochem，2001，40(20):5861-5869.

［4］Lau QC，Raja E，Salto-Tellez M，et al.RUNX3 is frequently inactivated by dual mechanisms of protein mislocalization and promoter hypermethylation in breast cancer［J］.Cancer Res，2006，66(13):6512-6520.

［5］Jin GS，Kondo E，Miyake T，et al.Expression and intracellular localization of FKHRL1 in mammary gland neoplasms［J］.Acta Med Okayama，2004，58(4):197-205.

［6］Morin PJ.Beta-Catenin signaling and cancer［J］.Bioessays，1999，21(12):1021-1030.

［7］Polakis P.Wnt signaling and cancer［J］.Genes Dev，2000，14(15):1837-1851.

［8］Torben H，Grete KJ，Karin Z.Correlation of growth fraction by Ki-67 and proliferatating cell nuclear antigen(PCNA)immunohistochemistry with histopathological parameters and prognosis in primary breast carcinomas［J］.Virchows Arch，1998，(433):223-228.

［9］劉君，方志沂，石松魁.保乳手術治療乳腺癌［J］.實用癌癥雜志，2003，18(4):403-405.