金花茶醇提物對人低分化鼻咽癌CNE-2細胞增殖和周期的影響

朱 華，鄒登峰，沈 潔，張可峰，張小玲，朱 林

(1廣西中醫學院，南寧 530022;2桂林醫學院)

金花茶是一種具有極高藥用價值的天然中草藥，民間稱其“神茶”。2009年5月～2010年11月，我們觀察了金花茶醇提物對人低分化鼻咽癌CNE-2細胞增殖和周期的影響，旨在為進一步研究金花茶抑制腫瘤細胞生長的機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 人低分化鼻咽癌細胞株CNE-2細胞(桂林醫學院科學實驗中心所提供);金花茶醇提物(桂林醫學院藥學院提取，用含10%小牛血清的DMEM培養基逐級對倍稀釋成各種實驗所需濃度);DMEM培養基(Gibco公司，美國);小牛血清(杭州四季青生物制品廠);胰蛋白酶(Sigma公司);甲基偶氮唑鹽(Amresco公司，美國);Hoechst33342熒光染料(凱基生物工程材料有限公司);其余試劑為進口或國產分析純。SW-CJ-2FD超凈工作臺，CO2細胞培養箱(Thermo Fisher公司，美國)，倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡(Olympus公司，日本);平板離心機，96孔培養板(Deta公司，美國)，FACScan型流式細胞儀(Becton Dickinson公司，美國)，普通及超低溫冰箱、電熱恒溫干燥箱、微量移液器等。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 將人低分化鼻咽癌細胞株CNE-2細胞接種于含10%滅活小牛血清，含青霉素、鏈霉素各100 U/ml的DMEM培養液中，細胞培養用50 ml培養瓶，置于37℃、5%CO2飽和濕度下的培養箱培養，3 d傳代1次，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 金花茶醇提物干預及細胞增殖抑制率檢測采用MTT法。取對數生長期的CNE-2細胞接種于96孔培養板，調整細胞密度為4×103/ml，每組設3個平行孔，24 h待細胞貼壁后，實驗組加入終濃度為 25、50、100、200、400 μg/ml的金花茶醇提物孵育，每孔200 μl，實驗中同時設陰性對照組(不加藥物的細胞懸液)和空白調零組(含10%小牛血清的DMEM培養基)。藥物作用24、48、72 h后加入20 μl(5 mg/ml)的MTT，繼續培養4 h，棄上清液，每孔加入150 μl DMSO，震蕩均勻 5 min，在酶標儀上測490 nm的吸光度(OD)值，計算細胞增殖抑制率及IC50。細胞增殖抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。

1.2.3 金花茶醇提物干預及細胞形態觀察 六孔板內每孔接種4×104個CNE-2細胞，24 h細胞貼壁后，分成實驗組和對照組，每組均設3個復孔，作用48 h后用倒置相差顯微鏡觀察并照相記錄實驗組和對照組細胞的形態變化。同時，采用多聚甲醛室溫固定，Hoechst 33342染色，熒光顯微鏡觀察照相。

1.2.4 金花茶醇提物干預及細胞周期及凋亡率檢測 取對數生長期細胞，每孔4×104個CNE-2細胞接種于六孔板中。培養24 h后細胞貼壁，實驗組加入 50、100、200 μg/ml的金花茶醇提物，對照組不加藥物。收集培養細胞，75%乙醇(4℃預冷)固定細胞過夜后送檢。樣本上機前將乙醇固定的細胞離心洗滌，加RNA酶(終濃度為0.5 g/L)，37℃水浴30 min，加碘化丙啶終濃度為1 g/L，振蕩混勻，30 min后上機檢測，進行細胞周期及凋亡率分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。計量數據以表示，各組間均數差異比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 細胞增殖抑制率 見表1。由表1可見，隨金花茶醇濃度增加，增殖抑制率逐漸升高，呈劑量依賴性。

2.2 細胞形態 ①倒置相差顯微鏡下觀察:鏡下見陰性對照組細胞呈延展、扁平貼壁生長，細胞清晰，細胞均質而透明，核膜、核仁輪廓明顯，細胞間結構緊密，生長旺盛。而經過48 h藥物處理后，50 μg/ml組的細胞形態變化不明顯，增殖受到抑制，生長緩慢，幾乎停滯。100 μg/ml組可見部分細胞皺縮變小、變圓，細胞間接觸變松，逐漸由貼壁而脫落。200 μg/ml組可見大量細胞形態變圓、收縮、破碎，折光性差，脫落細胞懸浮于培養液中。根據圖示隨著濃度的升高，生長抑制越明顯。②熒光顯微鏡下觀察:陰性對照組CNE-2細胞核呈現彌散均勻的淡藍色熒光，核飽滿、大小均勻。50 μg/ml金花茶醇作用48 h后出現細胞凋亡，凋亡的細胞體變小，與周圍細胞分離，呈現致密濃染的強藍色熒光。藥物濃度升至100 μg/ml時，細胞骨架解體，核固縮，邊聚致密濃染的強藍色熒光。200 μg/ml作用后，出現了核裂解，核染色質聚集，呈現明顯細胞凋亡形態。隨著藥物濃度的升高，凋亡細胞也逐漸增多。

表1 實驗組不同時點細胞增殖抑制率(%)

2.3 細胞周期及凋亡率 見表2。由表2可見隨著藥物濃度的增加，G1期細胞比例增高，S期、G2期細胞比例降低，與對照組比較有顯著性差異，且呈劑量依賴性。隨著金花茶醇提物濃度的升高，細胞凋亡率亦逐漸增高。

表2 兩組細胞周期及凋亡率比較(%，)

表2 兩組細胞周期及凋亡率比較(%，)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01

組別 G1期 S期 G2期 凋亡率實驗組50 μg/ml 57.76 ±0.242△ 31.10 ±1.047*10.57 ±0.321*11.39 ±3.166100 μg/ml 60.27 ±0.608*29.70 ±0.736* 9.62 ±0.350*23.96 ±1.046200 μg/ml 64.20 ±0.901*27.31 ±0.662* 8.48 ±0.378*35.40 ±1.035對照組 55.44 ±1.258 34.93 ±0.288 11.59 ±0.205 1.15 ±0.500

3 討論

金花茶屬無毒級，金花茶葉含有多種氨基酸、茶多酚、皂甙類、黃酮類等人體所需的有益成分，且富含對人體有重要的保健作用的微量元素。其可改善因高血壓引起的各種不適癥狀及抗菌消炎、清熱解毒、利尿消腫、增強肝腎臟活力、防止血動脈硬化，防癌抑制腫瘤生長等［1～3］。金花茶葉子在民間被用于清熱解毒、利尿利濕、止痢和止血等，《本草綱目》對它的藥用價值有一定記載。研究證實，金花茶對肝癌細胞株BEL-7404、人宮頸癌HeLa S3細胞、人前列腺癌PC3細胞及人單核細胞白血病細胞株U937細胞均有不同程度的抑制生長的作用［4～6］。

細胞周期監控機制的失控可發生在細胞增殖、損傷感應、DNA修復、細胞死亡等任何一個環節，從而引起細胞的基因組不穩定［7］。本研究發現，金花茶醇提物具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，且呈時間和劑量依賴性。倒置顯微鏡下觀察顯示隨著藥物濃度的增高，細胞變小皺縮，細胞間隙疏松，部分細胞懸浮。細胞周期是細胞分裂的完整體現，細胞周期的運轉是一個有序的基因調控過程(G1→S→G2→M)，這是細胞周期相關的基因在時間和空間上進行有序表達的結果，不能完成一個周期的細胞將進入程序化死亡或發生癌變。G1期監測點功能的失活是腫瘤細胞的重要標志。本研究證實，金花茶醇提物可將細胞阻滯于G1期，影響細胞周期繼續轉變的過程，進而減少進入G2和S期的細胞數目，減少其有絲分裂;阻滯效果與藥物作用濃度呈正相關。

金花茶醇提物能夠抑制CNE-2細胞的增殖，其作用機制可能與誘導其G1期阻滯有關。

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