腦膠質瘤組織中MCM5、Ki-67的表達及臨床意義

劉馨蓮，李淑蓉，殷 舞，孫 靜

(1成都醫學院，成都 610083;2廣西壯族自治區人民醫院)

細胞增殖調控異常與腫瘤的發生密切相關，DNA復制起始調控在細胞增殖調控中占核心地位。2007年8月～2009年4月，我們采用免疫組化法檢測腦膠質瘤組織中微小染色體維持蛋白5(MCM5)［1，2］、細胞增殖相關核蛋白(Ki-67)的表達，旨在進一步探討腦膠質瘤的發生機制。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇廣西壯族自治區人民醫院手術切除的腦膠質瘤組織44份(腫瘤組)，男25例，女19例;年齡4～73歲，平均36.8歲。術后均經病理確診，且術前未行放化療。根據2000年WHO神經系統腫瘤分類標準，Ⅰ級8例，Ⅱ級12例，Ⅲ級11例，Ⅳ級13例。另選同期因顱腦損傷行顱內減壓術手術切除的正常腦組織6份(正常組)，兩組一般資料無統計學差異。主要試劑:MCM5單克隆抗體(Neomakers Fremont公司)，鼠抗人Ki-67單克隆抗體與SP試劑盒(北京中杉生物試劑公司)，DAB試劑盒(福州邁新公司)。

1.2 MCM5、Ki-67表達檢測 采用免疫組化 SP法。全部標本均經10%中性甲醛固定，普通石蠟包埋，4 μm連續切片，DAB顯色。石蠟切片脫蠟水化后，微波抗原修復，過氧化酶阻斷劑滅活內源性過氧化物酶活性，羊血清工作液封閉，滴加一抗4℃過夜，滴加生物素標記的二抗，滴加鏈親和素一過氧化物酶溶液。DAB顯色，蘇木精復染。用已知陽性組織切片為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。結果判斷標準:MCM5和Ki-67的陽性細胞均為細胞核呈棕黃色。計算MCM5和Ki-67的標記指數(LI):選取10個陽性細胞最密集、背景最清晰區域，每個區域高倍視野下計算100個細胞中的陽性細胞數，計算1000個腫瘤細胞中陽性細胞所占的百分比，取其平均值。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。所有數據以表示，兩均數比較用t檢驗，相關分析采用Spearman等級相關分析法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 MCM5、Ki-67表達 腫瘤組、正常組MCM5的LI分別為 12.96 ±8.49、0，P ＜0.05;Ki-67 的 LI分別為 10.09 ±7.07、0，P ＜0.05。

2.2 MCM5、Ki-67表達與腦膠質瘤臨床病理特征的關系 見表1。

表1 MCM5、Ki-67的LI與腦膠質瘤臨床病理特征的關系(LI，)

表1 MCM5、Ki-67的LI與腦膠質瘤臨床病理特征的關系(LI，)

臨床病理特征 n MCM5 Ki67 P值性別男25 12.94 ±7.96 10.15 ±6.78 ＞0.05女19 13.00 ±9.37 10.00 ±7.62年齡(歲)＜40 22 7.87 ±5.14 5.70 ±3.60 ＞0.05≥40 22 18.06 ±8.18 14.47 ±7.01惡性程度Ⅰ級 8 3.70 ±1.53 3.11 ±1.41Ⅱ級 12 9.17 ±3.15 6.76 ±2.59 ＜0.05Ⅲ級 11 15.49 ±7.41 12.23 ±6.68Ⅳ級13 20.03 ±8.40 15.64 ±7.31

2.3 相關性分析 腦膠質瘤組織中MCM5與Ki-67 表達呈正相關(r=0.990，P ＜0.01)。

3 討論

腫瘤的發生、發展與細胞周期密切相關，而細胞周期又與DNA復制的起始調控相關。微小染色體維持蛋白家族是一組與DNA復制和細胞增生密切相關的蛋白家族［1］。目前證實MCM家族由MCM2、MCM3、MCM4(Cdc21)、MCM5(Cdc46)、MCM6(Mis5)和MCM7(Cdc47)6個亞單位組成，具有解鏈酶活性［3］，是真核生物DNA復制的主要調控因子。MCM蛋白與細胞周期密切相關，是啟動真核細胞DNA復制，調控細胞由G1期進入S期的關鍵蛋白［4］。在細胞周期中，MCM蛋白的表達在G1/S期達到峰值，細胞進入G0期和分化衰老時，MCM表達水平下降甚至不能測得，此特點使其成為反映細胞增殖活性的特異指標。Osaki等［5］研究表明，MCM蛋白能夠敏感而特異的反映細胞的增殖情況，在判斷腫瘤的惡性程度和評估預后方面具有重要意義。MCM5是MCM家族成員之一，其在靜止期的細胞中很少表達，在腫瘤組織細胞中大量表達，MCM5蛋白表達陽性是細胞具有增殖能力的標志，可作為腫瘤細胞增殖的標志［6］。

Ki-67是一種與細胞增殖密切相關的核抗原，存在于細胞周期的G1后期、S期、G2期和M期，是目前應用最為廣泛的增殖細胞標記之一［7］。研究顯示，Ki-67并非細胞增殖所必需的因子，其G1早期并無表達，而是在核糖體生物合成過程中發揮作用［8］，且Ki-67表達易受細胞外因素影響(如細胞的營養狀態)。因此，Ki-67可能僅能鑒定部分增殖細胞［9］。

本研究結果顯示，腫瘤組MCM5、Ki-67的LI明顯高于對照組，提示MCM5和Ki-67對區分正常腦組織和腦膠質瘤組織有一定參考價值;MCM5、Ki-67陽性表達與腦膠質瘤惡性程度密切相關，且隨惡性程度升高而升高，說明隨著腫瘤惡性程度的增加，有越來越多的細胞進入了增殖周期。可見MCM5和Ki-67蛋白表達水平可直接反映細胞的增殖活性。腫瘤組MCM5與Ki-67表達呈正相關，提示MCM5和Ki-67在標記具有增殖活性的腫瘤細胞中具有相同的意義;在各級腫瘤中MCM5的表達均高于Ki-67的表達，原因可能是處于G1早期的細胞無Ki-67的表達，而MCM5的表達在G1/S期達到峰值，說明MCM5不但能夠檢測增生活躍的細胞，還能檢測具有增生潛能的細胞［1］，MCM5是一種更為靈敏的增殖標志。

綜上所述，MCM5、Ki-67高表達在腦膠質瘤發生、發展中起重要作用。MCM5表達能更好的反映腫瘤細胞的增殖活性，具有潛在的臨床應用價值。

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