RANKL和M-CSF誘導THP-1細胞向破骨細胞樣細胞分化的研究

劉天云

(天津醫科大學口腔醫院，天津 300070)

很多骨骼疾病是由破骨細胞的分化和功能異常引起的，如巨頜癥、類風濕性關節炎、女性絕經后骨質疏松等。因此，對破骨細胞分化和功能的研究成為攻克這些疾病的關鍵。破骨細胞由單核細胞分化而來，在體外實驗中，多采用外周血單核細胞(PBMCs)、臍帶血單核細胞(UBMCs)和人類白血病單核細胞系U937和THP-1為前體細胞誘導得到破骨細胞樣細胞。破骨細胞分化需要兩個細胞因子——破骨細胞生成因子(RANKL)和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)［1］。PBMCs和 UBMCs直接在 RANKL和M-CSF的誘導下便可分化為破骨細胞樣細胞［1～3］。PBMCs和 UBMCs分化來的破骨細胞樣細胞更接近自然的破骨細胞，而U937和THP-1生成的破骨細胞樣細胞體積較小，核的數量也少。但是由于PBMCs和UBMCs的不能增殖且分離復雜，限制了對破骨細胞的研究。因此，最理想的單核細胞來源還是能夠無限增殖的單核細胞系。因為THP-1中可以檢測到RANKL受體mRNA［6］，故我們嘗試用RANKL和M-CSF直接誘導THP-1，看是否可以得到更接近天然的破骨細胞。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞因子RANKL和M-CSF購于美國Pepeotech公司，PMA購于美國Sigma公司，培養基RPMI粉末來自GIBCO公司，胎牛血清購于美國HyClone公司，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)試劑盒購于天津血液研究所，Ⅰ型膠原購于美國的Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 采用RPMI1640完全培養基，含100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%胎牛血清。細胞接種于75 ml培養瓶中，在37℃、5%CO2環境中培養，每3 d傳代換液。

1.2.2 玻璃片鋪膠原 將Ⅰ型膠原以1%的濃度溶于醋酸中，加入到鋪有玻璃片的48孔板中放置10 min，然后回收膠原，晾干。在接種細胞前用PBS清洗3次，晾干后使用。

1.2.3 誘導分化 將 THP-1細胞以1×105/ml的密度接種到鋪有玻璃片的48孔板中，加入濃度為1×107mmol/L的PMA刺激，每2 d換液除去未貼壁細胞，刺激4 d后停止。改加入RANKL(50 μg/ml)和 M-CSF(50 μg/ml)刺激，每3 d換液。

1.2.4 破骨細胞標志物檢測 將玻璃片從培養板中取出，對細胞進行破骨細胞特有標記物——TRAP細胞化學染色。光鏡下觀察，TRAP陽性的多核細胞被稱作破骨細胞樣細胞。

2 結果

THP-1細胞在PMA刺激4 d后從懸浮單核細胞分化為貼壁細胞，細胞體積增大，向周圍鋪展(圖1)。刺激到第10天時出現TRAP陽性的破骨細胞樣細胞，與TPA/1，25(OH)2D3刺激得到的破骨細胞相比，體積大，細胞核數量多(圖2)。

圖1 貼壁巨噬細胞

圖2 破骨細胞樣細胞

3 討論

THP-1細胞是從急性單核細胞白血病衍生來的，TPA刺激后從懸浮狀態分化為貼壁細胞，停止增殖［7］。THP-1可以分化為巨噬細胞，而且與其他單核細胞系分化來的巨噬細胞相比，更接近自然的巨噬細胞［8］。這提示THP-1細胞本身就有更接近天然單核細胞的性質。這可能是 THP-1可以在RANKL和M-CSF的誘導下分化為破骨細胞樣細胞的原因。

RANKL與其受體RANK結合后，通過多條信號通路激活多個核轉錄因子，這些核轉錄因子調節破骨細胞相關基因的表達。M-CSF是一種造血細胞生長因子，在破骨細胞分化過程中，它的主要作用是上調單核細胞內RANK的表達和支持細胞存活。RANKL和M-CSF都由間充質細胞和成骨細胞分泌。RANKL和M-CSF聯合誘導分化是破骨細胞生成的經典途徑，雖然有其他因子也可誘導破骨細胞分化，但是沒有RANKL和M-CSF被完全取代的情況。在目前發現的所有非經典途徑中RANKL是必須，而M-CSF可被其他因子替代。但是非經典途徑中的細胞因子不能完全代償M-CSF的功能，生成的破骨細胞與經典途徑得到的破骨細胞相比，在形態上或者功能上存在差異［9～12］。

TPA是人工合成的生物試劑，它能夠誘導THP-1和U937分化為巨噬細胞［8］，且刺激后能檢測到RANK的mRNA水平增高。應用TPA之后，1，25(OH)2D3能夠繼續上調RANK的 mRNA的表達。1，25(OH)2D3能夠刺激成骨細胞分泌 RANKL，有報道1，25(OH)2D3在造血細胞HL-60中抑制c-fms的 mRAN 的表達，c-fms是 M-CSF 的受體［13，14］。這些都暗示TPA/1，25(OH)2D3誘導的破骨細胞分化是與RANKL和M-CSF有密切關系的，是一條誘導破骨細胞分化的非經典途徑。在實驗過程中，我們發現傳代太久的THP-1細胞不能被TPA誘導為完全的貼壁細胞，細胞短暫貼壁后又恢復為懸浮細胞。這可能由于細胞被傳代次數太多，致使細胞的性狀發生了輕微的改變，對某些因子的刺激不再敏感。TRAP是破骨細胞特有的標志物，在以上試驗中我們驗證了THP-1在RANKL和M-CSF誘導能分化為TRAP陽性的破骨細胞樣細胞。在我們接下來的試驗中將驗證這些破骨細胞樣細胞的破骨功能。

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