IL-2對COPD患者CD8+T細胞頻率及功能的影響

徐晟偉，沈若武，張 蓓

(1青島市第三人民醫院，山東 青島 266021;2青島大學醫學院)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)發病機制十分復雜。有學者認為該病是一系列免疫反應引起，與氣道炎癥、氧化反應等因素有關［1］。IL-2是一個與感染密切相關的細胞因子，它在機體啟動免疫反應和炎癥反應中起著放大作用［2］。本研究通過測定COPD患者血清中 IFN-γ、IL-2濃度以及 IL-2對CD8+T細胞頻率和功能的影響，以期為臨床治療COPD提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究78例均為2008年11月～2010年5月青島市第三人民醫院呼吸內科住院患者，均符合2007年中華醫學會COPD診治規范標準。按疾病的不同嚴重程度及不同時期將COPD患者分為急性發作期組45例、臨床緩解期組33例。其中急性發作期組男28例、女17例，年齡55～81(62.4 ±7.9)歲;臨床緩解期男18 例、女15 例，年齡57～78(64.2±5.6)歲。排除有支氣管哮喘、支氣管擴張、肺結核、肺間質纖維化等病史者。另選同期來我院查體健康者25例為對照組，其中男18例、女7 例，年齡(64.1 ±9.1)歲;均無吸煙史。

1.2 方法

1.2.1 IL-2、IFN-γ血清濃度檢測 采用雙抗夾心ELISA方法檢測受試者血清IL-12、IFN-γ水平。取受試者血清及標準液各50 μl加入酶標板，37℃孵育30 min;每孔加酶標抗體 50 μl，37℃孵育 30 min。洗滌5次加底物顯色;終止反應后，酶標儀測OD值。

1.2.2 IL-2對CD8+T細胞頻率的影響檢測 ①外周血單個核細胞(PBMC)的提取:取淋巴細胞分離液加入離心管，毛細吸管加入等量的倍比稀釋血液，水平離心25 min。毛吸管輕輕吸取白膜層PBMC，洗滌后用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基重懸細胞，培養于6孔板中備用。PBMC分為以下兩組:IL-2刺激組，加入 IL-220 μl刺激;未刺激組，不加任何細胞因子刺激。孵育10 d后，檢測CD8+T細胞頻率。②CD8+T細胞頻率檢測:肝素抗凝全血200 μl加2 ml PBS 稀釋后，1000 r/min 離心 5 min后移棄上清;加20 μl PE 標記的 CD3、20 μl FITC 標記的CD8抗體于全血細胞中，設置同型對照;室溫避光孵育30 min，然后洗滌;加FACS裂解液室溫10 min;待細胞懸液變成真性溶液后洗滌2次;1 g/ml多聚甲醛200 μl重懸固定，流式細胞儀檢測，專用軟件分析。③胞內IFN-γ染色提取的PBMC設不同刺激組，10 d后加入 20 μl PE 標記的 CD3、20 μl FITC標記的CD8單克隆抗體及同型對照，室溫避光孵育20 min;加入500 μl 1× FACSTM TM 穿透液，室溫下避光孵育15 min，洗滌1次;分別加入20 μl熒光標記的IFN-γ抗體及同型對照，室溫下避光孵育20 min;洗滌2次，重懸于200 μl 1%多聚甲醛，上機檢測細胞內富含IFN-γ的CD8+T細胞頻率。

1.3 統計學方法 應用SPSS11.0統計軟件;樣本均數以表示;組間比較應用單因素方差分析或配對t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組血清中IL-2、IFN-γ濃度 COPD患者急性發作期血清IFN-γ、IL-2濃度較臨床緩解期組和對照組顯著增高(P均＜0.01)。臨床緩解期組血清IFN-γ、IL-2濃度低于急性發作期組，但仍高于對照組(P均＜0.01)。見表1。

表1 三組血清IL-2、IFN-γ濃度測定結果 (ng/L，)

表1 三組血清IL-2、IFN-γ濃度測定結果 (ng/L，)

注:與對照組比較，*P ＜0.01;與臨床緩解期組比較，△P ＜0.01

組別 n IL-2 IFN-γ急性發作期組 45 14.72±3.56＊△ 30.36±5.04＊△臨床緩解期組 33 8.41 ±2.97* 16.28 ±4.39*對照組25 4.86 ±2.26 10.33 ±3.44

2.2 IL-2刺激組及未刺激組CD8+T細胞頻率IL-2刺激組及未刺激組CD8+T細胞頻率分別為(42.76 ±3.75)%、(36.71 ±2.81)%。與未刺激組相比，IL-2刺激組 CD8+T細胞頻率增加(P＜0.05)。

2.3 IL-2刺激組及未刺激組CD8+IFN-γ+T細胞頻率 IL-2刺激組及未刺激組CD8+IFN-γ+T細胞頻率分別為(2.12 ±0.35)%、(1.31 ±0.2)%。與未刺激組相比，加入IL-2刺激組CD8+IFN-γ+T細胞頻率顯著增加(P＜0.05)。

3 討論

COPD是一種由各種細胞產生的多種細胞因子及炎癥介質介導的慢性炎癥性疾病，其氣道炎癥以T淋巴細胞、巨噬細胞和中性粒細胞浸潤為特征;在COPD患者的痰液和支氣管肺泡灌洗液中這些細胞的數量增加也說明了這一點［3］。由于COPD是由多種炎性細胞參與的免疫反應性慢性炎癥，所以有關COPD炎癥反應和免疫反應過程中的細胞因子已經成為研究的熱點。

IL-2、IFN-γ被認為是機體復雜免疫網絡中起調節作用的重要細胞因子。IL-2屬抗炎癥因子，其主要生物活性是刺激自然殺傷細胞增殖與分化并殺滅微生物［4］;而IFN-γ是細胞免疫的重要效應因子，是CD8+T細胞殺滅病原微生物的重要方式之一。另外，IFN-γ能誘導細胞免疫，促進THI細胞增生與活化，可介導T細胞對AMs的激活，刺激AMs分泌細胞因子［5］。本實驗結果顯示COPD患者血清中IL-2、IFN-γ水平明顯高于對照組，這與國外其他學者的報道一致［6］。而在臨床緩解期，隨著感染的緩解和控制，其釋放量也相應減少，從而進一步說明IL-2、IFN-γ參與了COPD發生發展的過程。

目前的研究顯示，在COPD患者的氣道壁中，浸潤的T淋巴細胞主要為CD8+T淋巴細胞，而且增加的CD8+T淋巴細胞數與COPD患者的氣流受限程度相關，從而說明CD8+T淋巴細胞在COPD氣道炎癥發展過程中起著重要作用［7］。為揭示IL-2是否通過影響CD8+T淋巴細胞發揮免疫學效應，本研究設置不同分組觀察其對CD8+T細胞頻率的影響。結果顯示用IL-2刺激后，CD8+T細胞頻率顯著增高，說明在COPD患者中，IL-2刺激了CD8+T細胞的增殖。

近年來研究提示，CD8+T細胞主要通過兩種途徑發揮免疫學效應:一種是CD8+T細胞對靶細胞的直接殺傷作用，即通過穿孔素和顆粒酶的釋放等殺傷感染細胞;另一種途徑主要是通過細胞因子的釋放，如 IFN-γ和 TNF-α等，達到其免疫殺傷的目的［8］。為驗證IL-2在促進CD8+T細胞頻率提高的同時是否會改善其功能，我們利用流式細胞分析技術合并胞內細胞因子染色技術觀察IL-2對不同組CD8+T細胞胞內IFN-γ分泌情況的影響，結果顯示加入IL-2刺激后，CD8+T細胞分泌IFN-γ功能增強。

綜上所述，COPD是一種由IL-2、IFN-γ等細胞因子介導的慢性炎癥，而IL-2可通過促進CD8+T細胞增殖，同時刺激CD8+T分泌IFN-γ參與COPD的發生發展過程。

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