α－干擾素聯合脂多糖對白血病細胞株U937細胞周期的影響及其機制研究

王曉桃，林文遠，陳蓓莉，劉健，唐愛林，莫東華

α－干擾素 (interferon－α，IFN－α)能夠抑制腫瘤細胞的生長，增加自然殺傷 (NK)細胞及其他免疫活性細胞的功能，具有廣譜的抗腫瘤活性，目前已被廣泛應用于血液系統腫瘤的治療。Toll樣受體 (Toll－like receptors，TLRs)是一類介導天然免疫反應并橋接或觸發適應性免疫的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)，TLRs可分布于各種腫瘤細胞，如結腸癌、乳腺癌、前列腺癌細胞［1］。如TLR1－9在U937細胞表達，且TLR8激動劑ssRNA40/LyoVec能明顯抑制U937細胞的生長［2］。人類TLR8天然或合成的配體能逆轉急性髓系白血病 (acute myelogenous leukemia，AML)患者Treg細胞的免疫抑制作用，進而增強抗瘤免疫功能［3］。這些研究提示TLR8配體可能在AML患者的免疫治療中具有重要作用。而作為TLRs主要外源性配體的內毒素脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)，需與其受體TLR4結合后通過信號轉導的級聯反應方能產生效應。因此，IFN－α+LPS能否協同阻滯白血病細胞的增殖及其機制需要進一步研究。本研究旨在探討LPS在體外能否增強IFN－α抑制U937細胞增殖、促進細胞凋亡、阻滯細胞周期的作用及可能機制。為IFN－α協同TLR激動劑或TLR配體佐劑免疫治療白血病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞 人AML細胞株U937(上海細胞所)自外室購進后復蘇后使用。

1.2 主要試劑與儀器 24孔、96孔培養板 (美國Corning公司);RPMI－Medium1640干粉、胎牛血清 (FBS)(天津血液病研究所);四甲基偶氮唑藍 (MTT)、二甲亞砜 (DMSO)溶液 (北京SABC公司產品);AnnexinV/碘化丙錠 (PI)試劑盒 (德國 Bender公司);Trizol試劑 (Invitroge公司產品);Western blotting化學發光試劑盒 (美國SantaCruz公司)，βactin Maker(Fermantas公司)，β－actin小鼠抗人單抗，CyclinA2、CyclinD1兔抗人單抗 (SantaCruz公司);山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG、兔抗山羊IgG(美國SantaCruz公司)。熒光抗體 (美國SantaCruz公司)。自動酶標讀數儀 (國產DG－3022);Fluor ChemTM8900凝膠成像系統 (美國Alpha Innotech公司);流式細胞儀 (美國BD公司)。

1.3 細胞傳代培養 AML細胞株U937從外室引進后，常規離心棄上清，復蘇后的細胞在含體積分數10%的加熱滅活的胎牛血清 (10%FBS) 及100 Μ/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640的培養基中，置于37℃、飽和濕度、體積分數為5%的CO2孵箱中培養，每3 d更換培養基并傳代一次。本實驗用的細胞均處于對數生長期。

1.4 MTT法檢測各組白血病細胞的增殖實驗 根據處理細胞的藥物不同將實驗組分為單用100 ng/ml IFN－α組、單用100 ng/ml LPS組，按上述劑量1∶1組成IFN－α+LPS組共3組;對照組則為不加任何藥物處理細胞即空白對照組。按實驗組的藥物劑量處理U937細胞株，混勻后取0.1 ml加入96孔平底培養板中，使細胞濃度為5×105/ml，每組重復8孔，對照組加入等體積培養液，每孔最終體積為200 μl。給藥后置37℃含5%CO2的培養箱中培養，每3 d更換1次培養液。在終止培養前4 h每孔加入20 μl濃度為5 mg/ml的MTT，繼續培養4 h后，2 000 r/min離心10 min，棄上清液，加150 μl/孔DMSO終止培養，使結晶溶解。置酶聯免疫檢測儀下測吸光度值(A)，計算其細胞生長抑制率〔細胞生長抑制率 (%) =(l－A處理組/A對照組) ×100%〕，如為對照組，則以第一孔為參照值，其余孔與其對照即可。

1.5 Annexin V FITC/PI雙染色法流式細胞儀檢測細胞凋亡率實驗分組同1.4。將人AML細胞株U937 0.1 ml置于10%FBS培養基中培養過夜，調節細胞密度至5×106/ml，按實驗分組再在含10%FBS的RPMI1640培養基中共同培育24 h后，收集細胞約5×105個，用Binding Buffer洗1次，100 μl Binding Bμffer重懸，加5 μl Annexin V －FITC，避光孵育20 min，再加10 μl PI(PI濃度為1mg/ml)避光室溫下孵育15 min，Binding Buffer洗滌、重懸，立即用流式細胞儀檢測，每個樣品至少檢測1×105個細胞。利用Cell Quest功能軟件進行參數獲取和數據分析。每組樣品重復3次。

1.6 流式細胞儀檢測細胞周期 實驗分組同1.4。將人AML細胞株U937在無血清培養液培養24 h，使細胞生長周期同步化，調節細胞密度至1×106/ml，按實驗分組再在含10%FBS的RPMI1640培養基中共同培育48 h后，600～800 r/min離心收集細胞，用PBS洗滌2次，DNA－Prepstain染液染色，用流式細胞儀檢測，每份樣品約5 000個細胞，用DNA Multi Cycle軟件進行統計學擬合分析各組細胞周期時相。每組樣品重復3次，取均數。

1.7 Western blotting檢測CyclinA2和CyclinD1蛋白質表達實驗分組同1.4。將對數生長期的U937細胞，調節細胞濃度至5×105～1×106個/ml。按實驗分組再在含10%FBS的RPMI1640培養基中共同培育24 h后，每組分別收集1×107個細胞，1 200 r/min，4℃離心5 min，用冰冷的PBS洗滌3次，再按1 200 r/min，4℃，離心5 min，棄上清液，加入100 μl的細胞裂解液和 1 μl DTT(1 mol/L)，10 μl PMSF(17.4 ng/ml)裂解細胞，加熱變性后置于4℃保存。取25 ml蛋白樣品進行SDS－PAGE電泳，將凝膠中的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，用封閉液 (質量濃度0.05脫脂奶粉，體積分數 0.001 Tween 20，Tris硼酸緩沖液溶解，pH 7.6)封閉2 h，轉移至含約10 ml 7%牛奶，1/2 000一抗的培養皿中孵育4 h，置入含10 ml 7%牛奶，1/3 000二抗的TBST液，室溫反應1 h，洗膜3次，ECL化學發光，X線片曝光顯影。(用β－actin作為內參照蛋白)。將各條帶進行灰度掃描并與β－actin條帶校正后計算各處理組平均值。

1.8 統計學方法 采用SPSS 15.0統計軟件進行數據分析，計量資料以 (±s)表示，多均數比較用單因素方差分析，兩均數比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IFN－α+LPS對白血病細胞株U937細胞增殖的抑制作用和凋亡作用 不同藥物與白血病細胞株U937作用48 h后，抑制率及凋亡率各組間比較差異均有統計學意義 (F值分別為42.11和56.43，P＜0.05)。IFN－α組、LPS組及IFN－α+LPS組的抑制率和凋亡率均較對照組明顯增高，差異有統計學意義 (P＜0.05);IFN－α+LPS組與IFN－α、LPS組比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05)，而IFN－α組與LPS組比較差異無統計學意義 (P＞0.05，見表1)。

2.2 IFN－α+LPS對U937細胞周期的影響 IFN－α組、LPS組及IFN－α+LPS組的U937 G1期比例增加、S期和G2期比例減少，而對照組中S期比例偏高、G1期和G2期比例偏少，組間差異有統計學意義 (F=31.62，P＜0.05，見圖2)。IFN－α組、LPS組及IFN－α+LPS組的G1期細胞較對照組明顯增高 (P＜0.05);IFN－α+LPS組G1期細胞明顯高于IFN－α、LPS兩組，差異均有統計學意義 (P值分別為0.02和0.05)。

2.3 IFN－α+LPS對CyclinA2、CyclinD1蛋白質的影響 用western blotting方法檢測3組中U9370細胞株 CyclinA2、CyclinD1蛋白質水平的變化情況，結果如圖3所示。獨立進行3次重復實驗，將各條帶進行灰度掃描并經β－actin條帶校正后計算各組的平均值，然后用SPSS 15.0軟件進行統計學分析。結果表明，IFN－α+LPS組CyclinA2蛋白表達量顯著下調，CyclinD1蛋白表達量顯著上調，組間差異有統計學意義 (F值分別為56.18和38.42，P＜0.05)，IFN－α組、LPS組及IFN－α+LPS組與對照組比較差異均有統計學意義 (P＜0.05)，IFN－α+LPS組與IFN－α組、LPS組比較差異有統計學意義(P＜0.05，見表3)。

表1 α－干擾素和 (或)脂多糖與U937細胞作用48 h后的抑制率和凋亡率 ( ± s，%)Table 1 The rate of cells inhabtion and apoptosis after IFN－α and/or LPS affection U937 cell lines

表1 α－干擾素和 (或)脂多糖與U937細胞作用48 h后的抑制率和凋亡率 ( ± s，%)Table 1 The rate of cells inhabtion and apoptosis after IFN－α and/or LPS affection U937 cell lines

0.07±0.03 0.08±0.04 IFN－α組 0.37±0.05 0.31±0.04 LPS組 0.30±0.07 0.25±0.05 IFN－α+LPS組組別 抑制率 凋亡率對照組0.69±0.04 0.51±0.13

圖2 流式細胞儀檢測U937細胞周期的改變Figure 2 The change of cell cycle phase induced by IFN－α and/or LPS in cell lines U937

表3 α－干擾素和/或脂多糖對U937對CyclinA2、CyclinD1蛋白質表達的影響Table 3 The expressing of CyclinA2 and CyclinD1 induced by IFN － αand/or LPS in cell lines U937

圖1 Annexin V FITC/PI雙染色法流式細胞儀檢測U937細胞凋亡的結果Figure 1 Cell apoptosis of U937 lines analyzed by FCM with AnnexinⅤ/PI double labeling method

表2 α－干擾素和 (或)脂多糖對U937細胞細胞周期分布的影響Table 2 Cell cycle after IFN－α and/or LPS affection U937 cell lines

圖3 Western blotting檢測U937 CyclinA2、CyclinD1蛋白質表達Figure 3 The expression of CyclinA2 and CyclinD1 protein induced by IFN－αand/or LPS in cell lines U937

3 討論

IFN－α是一種非常有效的抗腫瘤細胞因子，已經廣泛用于惡性血液病的治療并有顯著效果［3］。其治療急性白血病的機制主要是通過調節宿主免疫學反應的活性作用或通過對腫瘤細胞增殖的直接抑制作用發揮抗白血病效應［4］。本研究也證實了IFN－α較對照組而言，能顯著抑制細胞增殖、增加G1期細胞的比率、減少S期細胞的比率、增強白血病細胞凋亡。LPS是革蘭陰性細菌的細胞壁組成成分，其受體是TLR4。有研究報道TLR1－8在AML細胞株U937細胞均有表達，且運用TLR8激動劑ssRNA40/LyoVec能顯著抑制U937細胞增殖、阻滯細胞于G1期，但無明顯的促凋亡作用［5］。本研究發現100 ng/ml LPS較對照組而言，能顯著抑制U937細胞增殖，增加G1期細胞的比率，減少S期細胞的比率，增加細胞凋亡率。這與Manfred學者報道單用LPS能較弱地抑制白血病細胞增殖、增加細胞凋亡相一致［6］。本研究中將兩者以1∶1處理白血病細胞株U937，發現兩者聯合后較單用其中一種，其白血病細胞的增殖抑制率、細胞凋亡率及G1期細胞均有顯著地提高。這與Manfred等［6］學者報道IFN－α聯合LPS能明顯增強白血病細胞的凋亡相一致。這可能是LPS與U937細胞作用后，與TLR受體結合，通過MyD88依賴通路，募集IL－1R相關蛋白激酶 (IRAK)，經由信號分子腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)、p－轉化生長因子激活的蛋白激酶 (TAKl)、TAKl結合蛋白1和2(TAB1，TAB2)進入下游信號轉導，經p38、ERK等促分裂原活化的蛋白激酶 (MAPK)途經活化激活蛋白－1(AP－1)，誘導細胞因子如IL－1、IL－6、TNF－α、干擾素的表達［3］，從而增強IFN－α的抗白血病效應，也可能通過Fas相關死亡結構域蛋白 (FADD)依賴的途徑促使白血病細胞的凋亡、阻滯細胞于G1期［7］。

細胞周期分為G1、S、G2、M四個時期，存在G1－S和G2－M期兩個細胞周期檢測點。其中CyclinD1是Gl期運行的主要參與者，CyclinA2是S期DNA復制的必需條件，具有調節DNA合成及促進細胞進入有絲分裂的雙重作用［7］。本研究用IFN－α和 (或)LPS處理細胞后，白血病細胞株U937表達周期素CyclinA2蛋白的細胞數較對照組均顯著減少，而表達周期素CyclinDl蛋白的細胞數較對照組明顯增加。提示IFN－α能有效地通過調控CyclinA2和CycllnDl的表達，減少進入S期和M期細胞的比例，抑制細胞DNA的復制合成和細胞有絲分裂，使細胞更多地滯留于Gl期，無法進入S期，從而抑制細胞增殖，啟動細胞凋亡或衰老，最終走向死亡，達到抑制白血病細胞增殖的目的。將兩者以1∶1處理白血病細胞株U937，發現兩者聯合后較單用其中一種有顯著地改變。其機制可能是LPS與U937細胞作用后，激活TLRs的表達，介導天然免疫反應并橋接或觸發適應性免疫，促使大量的炎癥因子如IL－2、IL－8、CCL2、IFN－α及細胞間黏附分子的表達，增強IFN－α的作用，而IFN－α可直接刺激抑癌基因P53的表達，p53可以激活p21等基因的轉錄，p21是一種CKI分子，它能與S－cdk復合物結合，從而抑制CyclinA2蛋白的表達，阻滯細胞于G1期;也可能是干擾素與干擾素受體結合后，激活JAK－STAT途徑，促使G1－cdk的蛋白激酶活性增加，增強 CycllnDl蛋白的表達［8］。

綜上，IFN－α與LPS聯合使用可協同增強抗白血病作用，這可為IFN－α協同TLR激動劑或TLR配體佐劑的使用為臨床免疫治療白血病提供堅實的理論依據。

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3 Huang B，Zhao J，Unkeless JC，et al.TLR signaling by tumor and immune cells:a double edged sword［J］.Oncogene，2008，27(2):218－232.

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6 Manfred L，Marco B，Daniel S，et al.Caspase－8 dependent apoptosisinduction in malignant myeloid cells by TLR stimulation in the presence of IFN － alpha［J］.Leukemia Research，2008，31(12):1729－1741.

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8 Akira S.Toll－like receptor signaling［J］.J Biol Chem，2003，278(40):38105－38118.