高爾基體α－甘露糖苷酶Ⅱ在不同分化胃癌細胞和組織中的差異表達及意義*

朱 嫦， 楊雅瑩， 易永芬

(重慶醫科大學病理教研室，分子醫學與腫瘤研究中心，重慶400016)

胃癌是全世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，高居癌癥死因的第2位[1]。探討胃癌侵襲和轉移的相關機制并對其進行有效防治是長期以來的研究熱點。細胞表面糖蛋白的糖鏈結構尤其是N－聚糖的改變與腫瘤的惡性生物學行為密切相關[2－4]。高爾基體α－甘露糖苷酶Ⅱ(Golgi mannosidaseⅡ，GMⅡ)是N－聚糖形成中的關鍵性糖苷酶之一，其被特異性抑制后腫瘤細胞的生長和轉移明顯降低，因此GMⅡ可能成為抗癌治療的重要靶點[5－7]。GMⅡ在胃癌中的作用和意義國內外文獻均少見報道，本研究通過RT－PCR、免疫組織化學和Western blotting等方法分別檢測GMⅡ基因和蛋白在不同分化胃癌細胞系和組織中的表達，初步探討GMⅡ與胃癌的關系，為進一步研究GMⅡ在胃癌發生和發展中的作用奠定基礎。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 RPMI－1640培養基干粉、DEPC水和DMSO購自Sigma。小牛血清、胰蛋白酶購自Hy-Clone。SP免疫組化試劑盒及DAB染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司。Trizol購自Invitrogen。RT－PCR試劑盒和DNA marker購自寶生物工程大連有限公司。蛋白裂解液、BCA蛋白質定量試劑盒和蛋白marker購自碧云天生物技術公司。PVDF膜購自Millipore。MAN2A1(人GMⅡ基因)羊抗人多克隆抗體購自Santa Cruz?；瘜W發光試劑盒購自天根生物技術有限公司。兔抗人β－actin多抗、HRP標記兔抗羊IgG和HRP標記羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術公司。

1.2 組織和細胞來源 收集2008年10月－2010年10月重慶醫科大學附屬第一醫院胃癌患者手術切除標本，所有病例術前均未接受放化療。其中癌組織38例，正常癌旁胃黏膜組織30例(癌旁5cm以上)。其中高分化胃癌8例、中分化胃癌18例和低分化胃癌12例。手術標本取材后立即放入液氮罐保存，組織標本均經甲醛固定，石蠟包埋，每例蠟塊4 μm厚連續切片做免疫組化，所有病例均經過病理學診斷證實。永生化的人胃黏膜上皮細胞系(GES－1)購自第四軍醫大學細胞庫，高分化(MKN－28)、中分化(SGC－7901)和低分化(BGC－823)胃癌細胞系均為重慶醫科大學基礎醫學院分子醫學與腫瘤研究中心凍存。

2 方法

2.1 細胞培養及爬片制備 以上4種細胞均接種在含10%小牛血清、1×105U/L青霉素、1×105U/L鏈霉素的 RPMI－1640培養液中，37℃、5%CO2溫箱中培養，待細胞長到90%時進行傳代培養，將對數生長期細胞用0.25%胰蛋白酶消化，加含10%小牛血清的RPMI－1640培養液終止消化，接種于6孔板中(內置無菌載玻片)，待細胞長至80%時后吸出培養液，加4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗2遍后4℃保存備用。

2.2 免疫組化檢測GMⅡ蛋白的表達 組織石蠟切片:常規脫蠟至水，用3%H2O2作用10 min以阻斷內源性過氧化物酶干擾，枸櫞酸鈉緩沖液15 min抗原修復，PBS洗后血清封閉30 min，滴加1∶50 GMⅡ多克隆抗體4℃孵育過夜，PBS清洗5 min×3次后加生物素化的 II抗，抗37℃孵育30 min，PBS清洗5 min×3次后DAB顯色，蘇木素復染，脫水，中性樹膠封片，PBS代替I抗做陰性對照，每張切片至少觀察5個隨機高倍視野，按照陽性細胞所占比例記分:≤5% 為0分;6% －24%為1分;25% －50%為2分;＞50%為3分。同時根據染色強度記分為:無著色為0分;淡黃色為1分;黃色或深黃色為2分;褐色或深褐色為3分。兩項指標的積分相加結果:≤1分為陰性，＞1為陽性。細胞爬片:除無抗原修復外處理方法同石蠟切片，拍片后采用Image－Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算視野累積吸光度值(IA)，以吸光度值代表GMⅡ的相對含量。

2.3 RT－PCR檢測GMⅡmRNA的表達 按Trizol試劑盒說明提取各組組織和細胞的總RNA。瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀測定RNA的質量、濃度及純度。按RT－PCR試劑盒說明合成cDNA第1鏈GMⅡ引物序列如下:上游引物 5'－GTTTATTGTCGAAAGTCTCACACC －3'，下游引物 5'－ CACCTCAACTGGATTCGG －3'，擴增產物長度為126 bp;βactin上游引物5'－GCACCCAGCACAATGAAG －3'，下游引物 5'－GCCAATCTCATCTTGTTTTC －3'，擴增產物長度為356 bp，引物由上海生工合成。PCR反應條件如下:95℃預變性 2 min，94℃ 30 s，56℃30 s，72℃ 1 min，共30個循環，72℃ 10 min。結束后取反應產物5 μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。采用Quantity One軟件分析電泳條帶的灰度值，以βactin為內參照，以各條帶與內參照的灰度值的比值表示GMⅡmRNA的相對含量。

2.4 Western blotting檢測GMⅡ蛋白的表達 提取各組組織和細胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，樣品和上樣緩沖液以4∶1混合變性，SDS－PAGE電泳后電轉到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉1 h，加入GMⅡ抗體(1∶300)和 β －actin抗體(1∶400)，4 ℃孵育過夜，HRP標記 II抗(1∶1 000)孵育1 h，TBST洗脫3次，ECL化學發光顯影，采用Quantity One軟件測定條帶的吸光度值，以β－actin為內參照，以各條帶與內參照的吸光度的比值表示GMⅡ蛋白的相對含量。

3 統計學處理

結 果

1 免疫組化檢測GMⅡ蛋白在胃癌組織中的表達

GMⅡ陽性染色位于胞漿，為均勻一致的棕黃色顆粒。30例正常胃組織中陽性染色為53%(16/30)，8例高分化胃癌組織中的陽性染色為63%(5/8)，18例中分化胃癌組織的陽性染色為83%(15/18)，12例低分化胃癌組織的陽性染色為100%(12/12)，各組之間比較差異顯著(P＜0.05)，見表1、圖1。

表1 高、中、低分化胃癌組和正常胃黏膜組織組中GMⅡ的表達情況Table 1.The expression of GMⅡin well－differentiated，moderately differentiated and poorly－differentiated gastric cancer tissues and normal gastric tissues

2 免疫組化檢測GMⅡ蛋白在胃癌細胞系中的表達

正常胃黏膜上皮細胞系GES－1和3種胃癌細胞系MKN－28、SGC －7901、BGC－823染色平均吸光度分別為0.18±0.02、0.21±0.01、0.27±0.04、0.29±0.06，各組間差異顯著(P＜0.05，n=3)。GMⅡ在低分化胃癌細胞系BGC－823中表達最高;而在正常胃黏膜上皮細胞系GES－1中表達最低，見圖2。

3 RT－PCR檢測GMⅡmRNA在胃癌細胞系中的表達

Figure 1.The positive expression of GMⅡ protein by immunohistochemistry in four gastric tissues(SP，×400).A:human normal gastric tissues;B:well－differentiated gastric cancer tissues;C:moderately－differentiated gastric cancer tissues;D:poorly－differentiated gastric cancer tissues.圖1 免疫組化檢測GMⅡ在胃組織中的陽性表達

Figure 2.The positive expression of GMⅡ protein detected by immunohistochemistry in four gastric cell lines(SP，×400).A:GES－1;B:MKN－28;C:SGC－7901;D:BGC －823.圖2 免疫組化檢測GMⅡ在4種細胞系中的陽性表達

GMⅡmRNA在正常胃黏膜上皮細胞系GES－1與3種不同分化的胃癌細胞系中均呈陽性表達。與GES－1相比，3種胃癌細胞系MKN－28、SGC－7901和BGC－823中GMⅡmRNA的表達水平顯著增加，并且在低分化胃癌細胞系BGC－823中表達最高;而在高分化胃癌細胞系MKN－28中表達最低。各組之間比較差異顯著(P＜0.05)，見圖3。

4 RT－PCR檢測GMⅡmRNA在胃癌組織中的表達

Figure 3.Expression of GMⅡ mRNA detected by RT－PCR infour gastric cell lines.M:DNA marker;Lane 1:GES－1;Lane 2:MKN－28;Lane 3:SGC－7901;Lane 4:BGC－823.±s.n=3.*P＜0.05 vs GES－1.#P＜0.05 vs SGC－7901;△P＜0.05 vs BGC－823.圖3 RT－PCR檢測4種胃細胞系中GMⅡmRNA的表達水平

GMⅡmRNA在30例正常胃黏膜組織、8例高分化胃癌組織、18例中分化胃癌組織和12例低分化胃癌組織中相對含量分別為0.25±0.13、0.40±0.27、0.58±0.56和0.74±0.23。GMⅡmRNA在正常胃黏膜組織中GMⅡ表達最低，低分化胃癌組織中表達最高，各組間比較差異顯著(P＜0.05)，見圖4。

5 Western blotting檢測GMⅡ蛋白在胃癌細胞系中的表達

內參照β－actin位于42 kD位置，條帶粗細亮度基本一致，沒有顯著差異，4種細胞系在132kD處均出現GMⅡ的陽性表達，與β－actin蛋白的灰度比值顯示GMⅡ蛋白在GES－1中的表達量最低，在MKN－28、SGC－7901和BGC－823 3組不同分化的胃癌細胞系中表達逐漸增加，分化越差，GMⅡ蛋白的表達越高。各組之間比較差異顯著(P＜0.05)，見圖5。

6 Western Blotting檢測GMⅡ蛋白在胃癌組織中的表達

Figure 4.Expression of GMⅡmRNA detected by RT－PCR in four gastric cell tissues.M:DNA marker;Lane 1:human normal gastric tissues;Lane 2:well－differentiated gastric cancer tissues;Lane 3:moderately－differentiated gastric cancer tissues;Lane 4:poorly－differentiated gastric cancer tissues.±s.n=3.*P＜0.05 vs group 1.#P ＜0.05 vs group 3;△P ＜0.05 vs group 4.圖4 RT－PCR檢測4種胃組織中GMⅡ的基因表達水平

Figure 5.Expression of GMⅡ protein detected by Western blotting in four gastric cell lines.Lane 1:GES－1;Lane 2:MKN－28;Lane 3:SGC－7901:Lane 4:BGC－823.±s.n=3.*P＜0.05 vs GES－1.圖5 Western blotting檢測4種胃細胞系中GMII蛋白的表達水平

GMⅡ蛋白在30例正常胃黏膜組織、8例高分化胃癌組織、18例中分化胃癌組織、12例低分化胃癌組織中相對含量分別為0.12±0.03、0.33±0.24、0.49±0.17和0.62±0.51，GMⅡ在正常胃黏膜組織中表達最低，在中、低分化胃癌組織中表達最高，高分化胃癌組織中表達居中。各組之間比較差異顯著(P ＜0.05)，見圖6。

Figure 6.Expression of GMⅡ protein detected by Western Blotting in four gastric cell tissues.Lane 1:human normal gastric tissues;Lane 2:well－differentiated gastric cancer tissues;Lane 3:moderately－differentiated gastric cancer tissues;Lane 4:poorly－differentiated gastric cancer tissues.圖6 Western blotting檢測4種胃組織中GMⅡ的蛋白表達水平

討 論

惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移實質上是細胞與其周圍環境(包括相鄰細胞、細胞外可溶性生物活性分子及不溶性細胞外基質)之間相互作用失常所致，而細胞表面正是介導了細胞與周圍環境的相互作用。細胞表面以糖蛋白分布最為廣泛，如信號分子的受體、細胞黏附分子等。糖蛋白借助其糖鏈所攜帶的多種多樣的生物識別信息，實現細胞與周圍環境的聯系，從而影響細胞的存活或凋亡、增殖與分化、遷移與侵襲等活動[8]。因此，細胞表面糖蛋白的的改變與腫瘤的生物學行為，如惡性轉化、轉移與侵襲等密切相關[9]。

糖蛋白是糖鏈通過N－糖基化和O－糖基化作用修飾蛋白質而形成。α－甘露糖苷酶是蛋白質N－糖基化修飾中關鍵性糖苷酶，它通過剪切N－糖鏈甘露糖殘基而在聚糖從高甘露糖型轉化成復雜型結構中起著重要的作用。迄今為止，已克隆的α－甘露糖苷酶cDNA有20多種，其中來自人類的有6種。高爾基體α－甘露糖苷酶Ⅱ(GMⅡ)在哺乳動物組織中分布廣泛，它位于高爾基體的反面和中間體，分子量約為132 kD，其cDNA與鼠科動物的相近，位于5號染色體。GMⅡ分 子中含有糖基水解酶家族38(glycosyl hydrolase family 38)的保守序列，因此能特異性地剪切GlcNAc2Man5GlcNAc上 α －1，3和 α －1，6連接的甘露糖殘基，形成 Glc2Man3GlcNAc[10]。

研究表明，GMⅡ與多種類型腫瘤的侵襲和轉移行為密切相關。在乳腺、結腸及皮膚癌中，GMⅡ所引起的細胞表面復合糖數量分布的異常促進了腫瘤的發生發展，其臨床預后更差。GMⅡ被苦馬豆堿(swainsonine，SW)特異性抑制后，細胞表面的N－聚糖發生改變，肝癌細胞的黏附和遷移行為被明顯抑制;正常尿路上皮及膀胱癌細胞GMⅡ被SW抑制后，其與纖維連接蛋白及IV型膠原纖維結合能力分別增加1.5及2倍，同時膀胱癌細胞的遷移率下降20%;在惡性黑色素瘤和淋巴瘤中也有類似的研究發現[11，12]。GMⅡ促進腫瘤的侵襲和轉移的確切機制目前并不清楚。有研究者認為，GMⅡ可能通過對糖蛋白分子的質量控制、成熟、運輸以及分泌來調控細胞之間、細胞與細胞外基質之間的識別[13]。GMⅡ抑制后腫瘤細胞與血管內皮細胞的黏附降低、對LAK和NK細胞的殺傷敏感性增強、細胞表面整合素糖蛋白分子中的寡糖基與其它細胞的配體結合受阻或者通過細胞表面凝集素介導的凋亡等均提示GMⅡ可能成為抗癌治療的重要靶點[11，12]。

GMⅡ蛋白在胃癌中作用目前研究較少，國內研究者[13]曾用SW處理的胃癌細胞接種至裸鼠，結果顯示裸鼠體內成瘤能力及轉移能力均降低，這提示GMⅡ在胃癌的發生和發展中可能發揮重要的作用。但是，SW對GMⅡ抑制的非特異性(SW同時抑制細胞漿、溶酶體α－甘露糖苷酶)[6]以及體內實驗中SW抗癌作用的發揮可能是通過免疫調節機制而非抑制GMⅡ，使得GMⅡ在胃癌發生和發展中的具體作用有待更加深入的研究。在癌變過程中，為糖鏈合成酶編碼的基因表達異常或發生突變或活性異常是導致糖鏈結構形成發生異常的重要原因。GMⅡ基因及其蛋白在胃癌中的表達情況國內外文獻均鮮見報道。前期實驗中我們已應用免疫組化法研究分析了GMⅡ與臨床病理特征之間的關系，表明GMⅡ在胃癌的發生發展、侵襲遷移中可能扮演著重要的角色[14]。本研究進一步通過RT－PCR、免疫組化法和Western blotting等方法分別檢測GMⅡ基因和蛋白在3種不同分化胃癌細胞系及胃癌組織中的差異表達。結果顯示，與正常胃黏膜上皮相比，3種胃癌細胞系MKN－28、SGC－7901、BGC－823中GMⅡ的基因及蛋白表達水平顯著增加。并且，GMⅡ在低分化胃癌細胞系BGC－823中表達最高;而在高分化胃癌細胞系MKN－28中表達最低。此外，本研究還應用同樣方法對不同分化的臨床組織標本進行進一步研究，結果顯示，GMⅡ表達水平在正常胃組織中最低，在低分化胃癌組織中表達最高，結果與對細胞系的研究結果一致。這進一步提示GMⅡ參與了胃癌的發生和發展，GMⅡ蛋白表達與胃癌的分化程度相關;而胃癌組織中GMⅡ基因表達的增高，為以GMⅡ為靶點的基因治療提供重要的理論基礎。

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