NKX3.1下調前列腺癌PC－3細胞中抗凋亡基因bcl－2的表達*

陳兆波， 劉春艷， 倪娜娜， 于 洋， 張鵬舉， 陳蔚文， 崔福愛， 姜安麗

(山東大學醫學院生物化學與分子生物學研究所，山東濟南250012)

NKX3.1是前列腺特異性和雄激素調控的同源框基因[1]，它與前列腺的發育、成熟[2，3]及前列腺癌的發生發展密切相關[4]。NKX3.1基因位于染色體8p21區域[5]，基因全長約 4 223 bp，具有 2 個外顯子，1個內含子，編碼234個氨基酸，其表達產物屬于核轉錄因子。大約80%的前列腺癌細胞會雜合缺失該區域[6，7]，它的表達缺失與前列腺癌的發生發展有關，而且決定了腫瘤發生的組織特異性，這表明NKX3.1可能是一種潛在的抑癌基因[8]。研究認為NKX3.1蛋白可能是通過激活caspase凋亡途徑，及誘導凋亡抑制基因bcl－2的表達，起到誘導前列腺癌細胞凋亡的作用[9]，但NKX3.1在前列腺癌發生發展中的確切作用機制仍不清楚。本實驗將NKX3.1真核表達載體pcDNA3.1－NKX3.1轉染前列腺癌PC－3細胞，研究NKX3.1對抗凋亡基因bcl－2表達的影響及對前列腺癌細胞凋亡的作用，為進一步研究NKX3.1在前列腺腫瘤中的作用奠定基礎。

材料和方法

1 主要材料

pcDNA3.1載體、Trizol試劑和質粒抽提試劑盒購于Invitrogen;Taq酶和PCR試劑盒購于大連寶生物工程公司;M－MuLV逆轉錄酶和快速凝膠回收試劑盒購于Fermentas;大腸桿菌JM109由本室保存;NKX3.1真核表達載體pcDNA3.1－NKX3.1由本課題組克隆構建[9];前列腺癌PC－3細胞株購于中科院上海細胞所;鼠抗人Bcl－2購于Santa Cruz，羊抗鼠IgG購于北京中衫金橋;RPMI－1640培養基購于HyClone;胎牛血清購于四季青公司;其余為國產分析純。

2 方法

2.1 細胞培養 前列腺癌PC－3細胞生長于含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及1×105U/L鏈霉素的RPMI－1640培養基，在37℃、5%CO2條件下培養。

2.2 細胞轉染 前列腺癌PC－3細胞以5×108/L接種于50 mL培養瓶中。當細胞融合度＞90%時，按照FuGENE? HD轉染試劑說明將pcDNA3.1－NKX3.1載體轉染 PC －3細胞(PC3－NKX3.1+)，對照組將相同劑量pcDNA3.1空載體轉染PC－3細胞(PC3 －NKX3.1－)，每瓶以 16 μL FuGENE? HD 轉染試劑+8 μg質粒DNA+4 mL 10%胎牛血清RPMI－1640培養基轉染。

2.3 RT－PCR檢測bcl－2 mRNA的表達 前列腺癌PC－3細胞在轉染 pcDNA3.1－NKX3.1載體或pcDNA3.1空載體48 h后，用Trizol一步法提取細胞總RNA，使用隨機六聚體引物和M－MuLV逆轉錄酶將細胞總RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，PCR擴增bcl－2 mRNA片段(304 bp)。PCR引物正義鏈5’－GTGGAGGAGCTCTTCAGGGA －3’，反義鏈5’－AGGCACCCAGGGTGATGCAA－3’。內參照 β－actin正義鏈5’－GTGGGGCGCCCCAGGCACCA－3’，反義鏈 5’－CTCCTTAATGTCACGCACGATTT－3’，擴增β－actin片段550 bp。PCR反應條件相同，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，凝膠成像系統采集圖像。

2.4 Western blotting檢測Bcl－2蛋白表達 前列腺癌PC－3細胞在轉染pcDNA3.1－NKX3.1載體或pcDNA3.1空載體48 h后，用細胞裂解液(50 mmol/L Tris－ HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，0.1%SDS，1%NP－40，1×蛋白酶抑制劑)收集細胞總蛋白。BCA法定量后，Ⅰ抗為1∶200稀釋的鼠抗Bcl－2，Ⅱ抗為1∶2 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG。以β－actin為內參照，加入ECL顯色劑顯色，暗室中曝光X光片觀察。

2.5 EMSA檢測 NKX3.1與bcl－2基因上游調控區中的NKX3.1結合元件相互作用 前列腺癌PC－3細胞在轉染pcDNA3.1－NKX3.1載體或空載體48 h后，收集細胞，制備細胞核蛋白。通過分析軟件MatInspector 2.2檢測在 bcl－2基因啟動子上游－1 146 bp至－1 153 bp處有一個NKX3.1結合元件序列(nucleotide－binding site，NBS)，人工合成雙拷貝NBS及互補鏈，NBS正義鏈為ATACCAAGTATTTATACCAAGTATTT(雙拷貝)。以TEN緩沖液(10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L NaCl，pH8.0)分別溶解NBS單鏈，等摩爾比混合2條單鏈，加熱退火生成雙鏈NBS，按Roche提供的DIG Gel Shift Kit說明，用末端轉移酶對其進行末端地高辛標記，作為EMSA檢測中的探針。設置6個反應管:(1)標記探針不加核蛋白;(2)標記探針加核蛋白;(3)標記探針加核蛋白及125倍過量的未標記的同源探針;(4)標記探針加核蛋白及125倍過量的未標記的異源探針;(5)標記探針加核蛋白及NKX3.1抗體;(6)標記探針加轉染空載體的PC－3核蛋白(作為陰性對照)。室溫反應20 min，然后進行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移凝膠條帶至陽離子尼龍膜，加地高辛抗體及顯影底物CSPD，曝光X光膠片，觀察電泳遷移率的改變。

2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 前列腺癌PC－3細胞在轉染pcDNA3.1－NKX3.1載體或pcDNA3.1空載體48 h后，用胰酶消化收集細胞，70%預冷乙醇固定，4℃冰箱放置12 h以上，按照Sub－G1法以流式細胞儀檢測凋亡細胞并分析細胞的周期分布。

2.7 Hoechst 33258染色檢測細胞凋亡 前列腺癌PC－3細胞在轉染pcDNA3.1－NKX3.1載體或pcDNA3.1空載體48 h后，使用Hoechst 33258凋亡檢測試劑盒染色，紫外燈下激發，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態，熒光成像系統采集圖像。

結 果

1 NKX3.1下調bcl－2 mRNA的表達

結果顯示，與轉染pcDNA3.1載體對照組相比，轉染pcDNA3.1－NKX3.1載體的PC－3細胞中 bcl－2 mRNA的表達明顯下降，見圖1。

Figure 1.The effects of NKX3.1 on the expression of bcl－ 2 mRNA in PC －3 cells.M:marker;1:PC －3(NKX3.1－);2:PC－3(NKX3.1+).±s.n=3.*P ＜0.05 vs PC －3(NKX3.1－).圖1 NKX3.1對PC－3細胞中Bcl－2 mRNA表達的影響

2 NKX3.1下調Bcl－2蛋白的表達

結果顯示，與轉染pcDNA3.1載體對照組相比，轉染pcDNA3.1－NKX3.1載體的PC－3細胞中Bcl－2蛋白的表達明顯下降，見圖2。

Figure 2.The effects of NKX3.1 on the expression of Bcl－ 2 protein in PC －3 cells.1:PC －3(NKX3.1－);2:PC－3(NKX3.1+).±s.n=3.*P＜0.05 vs PC－3(NKX3.1－).圖2 NKX3.1對PC－3細胞中Bcl－2蛋白表達的影響

3 NKX3.1與bcl－2基因上游調控區中的NKX3.1結合元件相互作用

圖3顯示，轉染 pcDNA3.1－NKX3.1的 PC －3細胞核提取液中具有與NBS結合的蛋白(3泳道)，此結合可被同源序列競爭抑制 (4泳道)，而不被異源序列競爭抑制(5泳道)，并可被特異的NKX3.1抗體阻斷(6泳道)。PC－3細胞不表達NKX3.1蛋白，轉染pcDNA3.1空載體的PC－3核蛋白中沒有與NBS的結合蛋白帶(2泳道)。說明NKX3.1可與bcl－2基因上游調控區中的NKX3.1結合元件特異結合，調節bcl－2基因的表達。

Figure 3.The interaction of NKX3.1 with NKX3.1 －binding element in upstream of bcl－2 gene detected by EMSA.1:NBS probe;2:NBS probe+nucleoprotein of PC3－ NKX3.1－;3:NBS probe+nucleoprotein of PC3－ NKX3.1+;4:NBS probe+nucleoprotein of PC3－NKX3.1++125 － fold excess NBS unlabled;5:NBS probe+nucleoprotein of PC3 － NKX3.1++125－fold excess ARE unlabled;6:NBS probe+nucleoprotein of PC3 － NKX3.1++NKX3.1 antibody.圖3 EMSA檢測NKX3.1與bcl－2基因上游調控區中的NKX3.1結合元件相互作用

4 NKX3.1誘導PC－3細胞凋亡

結果顯示，NKX3.1可使PC－3細胞凋亡數目明顯增加，細胞凋亡數由7.00%增加至16.88%，見圖4。

Figure 4.NKX3.1－induced apoptosis of PC －3 cells detected by flow cytometer.PC3 － NKX3.1+:PC － 3 cells transfected with pcDNA3.1 － NKX3.1 vector;PC3 －NKX3.1－:PC － 3 cells transfected with pcDNA3.1 vector.圖4 流式細胞術檢測NKX3.1對PC－3細胞凋亡的影響

PC－3細胞轉染48 h后，同時使用Hoechest 33258凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。可發現轉染pcDNA3.1－NKX3.1載體后，細胞凋亡小體數量明顯增加，見圖5。

Figure 5.NKX3.1－induced apoptosis of PC －3 cells detected by Hoechst 33258 staining(×100).PC3－NKX3.1+:PC －3 cells transfected with pcDNA3.1 － NKX3.1 vector;PC3 － NKX3.1 －:PC －3 cells transfected with pcDNA3.1 vector.圖5 Hoechst 33258染色檢測NKX3.1對PC－3細胞凋亡的影響

討 論

NKX3.1是前列腺特異性表達的同源盒基因，受雄性激素調節，其產物在結構與功能上屬于核轉錄因子[10]，發揮抑制前列腺上皮增生及維持分化的作用。有關NKX3.1蛋白功能的研究較少，其在前列腺癌發育和發生過程中的作用及機制并不是十分清楚。本實驗選用的前列腺癌細胞株PC－3細胞是一種雄性激素非依賴性生長并且NKX3.1基因缺陷的細胞株，通過瞬時轉染NKX3.1真核表達載體pcDNA3.1－NKX3.1，使 NKX3.1 在 PC －3 細胞中重新表達，在此基礎上研究NKX3.1在前列腺癌中的作用，并通過流式細胞術和凋亡小體染色檢測方法證明NKX3.1可促進細胞凋亡。

細胞的凋亡受多種基因的影響，是一個涉及多基因、多分子水平變化的多階段過程，在其過程中不同功能的基因和分子對細胞所產生的影響協同調節細胞凋亡。眾多研究表明bcl－2基因是抗細胞凋亡的重要基因[11，12]，與腫瘤耐藥和放療耐受關系密切，其過度表達可抑制細胞凋亡，并導致細胞增殖與程序性細胞死亡失衡[13，14]。Hockenbery 等[12]認為 bcl－2基因家族在細胞凋亡調控中的作用具重要意義，而且近年研究也發現bcl－2在腫瘤中高表達可以使腫瘤的耐藥性增加，增強的bcl－2表達在前列腺癌扮演重要角色。研究表明[15]，在 NKX3.1與 p27KIP1缺失的前列腺癌細胞中恢復這2個基因的表達時，可明顯抑制前列腺癌細胞增殖并促進細胞凋亡;實驗更進一步發現NKX3.1與p27KIP1這2個基因的協同作用可以降低抗細胞凋亡基因bcl－2以及下游產物bax的表達。但是，目前NKX3.1是否可以直接影響bcl－2基因的表達尚未見文獻報道。

本研究中，在瞬時轉染NKX3.1表達載體后，通過RT－PCR和 Western blotting檢測發現，bcl－2 mRNA和Bcl－2蛋白的表達水平明顯下降。通過分析軟件MatInspector2.2檢測在bcl－2基因上游有一個NKX3.1結合元件序列(NBS)，人工合成NBS通過EMSA檢測NKX3.1與bcl－2基因上游調控區中的NKX3.1結合元件相互作用。結果顯示，轉染pcDNA3.1－NKX3.1的PC－3細胞核提取液中具有與NBS結合的核蛋白，并通過競爭結合實驗及特異抗體阻斷實驗證明此結合是特異性的，而轉染pcDNA3.1空載體的PC－3核蛋白中沒有與NBS的結合蛋白帶。說明NKX3.1與bcl－2基因上游調控區中的NKX3.1結合元件特異結合，可在轉錄水平上調節bcl－2基因的表達。

我們的實驗結果表明NKX3.1可在轉錄水平下調抗凋亡基因bcl－2的表達，促進前列腺癌細胞凋亡。此結果為進一步研究NKX3.1促進細胞凋亡機制及其在前列腺癌中的作用奠定了基礎。

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