電針耳甲對癲癇大鼠行為學和腦電圖的影響*

何 偉， 趙長龍， 李艷華， 高昕妍， 李 亮， 賁 卉， 榮培晶， 朱 兵

(中國中醫科學院針灸研究所，北京100700)

癲癇是腦神經元異常放電反復發作所致的突然短暫中樞神經系統功能失常的一組臨床綜合征[1]。目前對于癲癇的治療包括藥物治療、手術治療、以及非藥物替代療法。非藥物替代療法包括深部腦刺激[2]和迷走神經刺激療法(vagus nerve stimulation，VNS)[3]等。VNS于1997年被美國 FDA批準用于12歲以上的難治性癲癇病人的輔助治療，主要通過在頸部放置刺激器，刺激左側頸部迷走神經干，達到治療癲癇的效應。迄今為止，全世界有超過70個國家的60 000多名癲癇患者接受了這種治療。

迷走神經在體表的唯一分支分布于耳甲和外耳道，刺激耳甲是否可以起到治療癲癇的效應，此種效應與常用治療癲癇的督脈經穴大椎(Du Meridian 14，DU 14)[4]比較有何差異?本實驗擬從行為學、電生理學等方面觀察電針耳甲治療癲癇大鼠的效應，為臨床治療癲癇尋找更簡、便、廉、驗的方法，同時為進一步探討耳針的效應機制提供的理論依據。

材料和方法

1 動物

健康成年Sprague-Dawley大鼠48只，雄性，體重(300±29)g，由中國醫學科學院實驗動物中心提供，清潔級。合格證號為SCXK(京)2009-0008。

2 主要試劑和設備

戊四唑(pentylenetetrazole，PTZ，P6500-25G，Sigma);滂胺天蘭 (北京化學試劑公司);計算機恒溫控制儀(STARC ST-360);腦立體定位儀;顱骨鉆(The Foredom Electric Co.);刺激器(SS-102J，Nikon Kohden);微電極推進器(PF5-1);微電極放大器(Xcell-3 Microelectrode Amplifier，FHC);微電極放大器(World Precision Instruments，WPI);CED1401-plus數據采集系統(Cambridge Electronic Devices);玻璃微電極拉制儀(Model P-97);雙芯玻璃毛坯(長度100 mm，外徑1.5 mm，內徑1.2 mm，南京);雙銀球電極(自制，球徑1 mm);圓形雙銀片電極(自制，直徑1.5 mm);C型雙極銀質電極(自制，C型凹槽直徑3 mm);烏拉坦(ethylurethanm，化學純，北京化學試劑公司)。

3 主要方法

3.1 動物分組及處理 (1)行為學實驗:大鼠24只，隨機分為模型組、大椎治療組(大椎組)和耳甲治療組(耳甲組)，每組各8只。模型組大鼠造成癲癇模型，觀察30 min大鼠行為學的變化;大椎組大鼠電針“大椎”穴30 min后立即造模，觀察30 min大鼠行為學的變化;耳甲組大鼠電針耳甲30 min后立即造模，觀察30 min大鼠行為學的變化。(2)電生理實驗:大鼠24只，隨機分為大椎治療組(大椎組)、耳甲治療組(耳甲組)和VNS組，每組8只。分別觀察造模后電針耳甲、電針“大椎”以及VNS對大鼠腦電圖(electroencephalogram，EEG)的影響。

3.2 造模方法 腹腔注射PTZ 60 mg/kg造成急性癲癇模型[5]。

3.3 迷走神經分離術 將大鼠用10%烏拉坦(1.2 g/kg)腹腔注射麻醉。仰臥于手術臺，頸部備皮，正中切口長約5 cm，切開皮膚及淺筋膜，沿左側胸骨舌骨肌及胸骨乳突肌肌間溝進入，顯露左側頸動脈鞘，可見迷走神經位于鞘內，玻璃分針分開頸動脈鞘，游離左側迷走神經干1 cm備用。將自制C型雙極銀質電極刺激端無張力地鉤于迷走神經干上，兩電極相距1-2 mm，將蘸有無菌恒溫石蠟油的小棉條輕輕塞于C型電極凹槽內固定迷走神經干(小棉條還可以防止組織干燥和電極短路)，縫合傷口。VNS時C型電極遠端與電刺激器相連接。

3.4 硬膜外EEG記錄 大鼠10%烏拉坦(1.2 g/kg)麻醉，俯臥，將頭部用耳棒固定于腦立體定位儀上。頭頂部備皮，沿正中矢狀線切開皮膚，分離皮下組織，刮骨刀刮除骨膜，暴露前后囪，將前后囪調至同一水平。根據大鼠腦立體定位圖譜(Paxinos＆Watson，1998)，在前囟前(A:1.0 mm，L:1.0 mm)、前囟后(A:-1.0 mm，L:1.0 mm)顱骨表面，用顱骨鉆鉆孔，暴露硬腦膜。雙銀球電極置于前囟前、后各一小孔內硬腦膜上，2%瓊脂固定。銀球電極另一端與微電極放大器相連接。雙銀球電極另一端接于WPI微電極放大器，放大的電信號經CED 1401計算機數據采集系統采集，數據由Spike 2軟件包分析處理。

3.5 刺激方法 選用1.0寸毫針，針刺耳甲或“大椎”穴。“大椎”穴參照實驗針灸學定位[6]。VNS或電針時，接于電刺激器。刺激參數根據VNS治療癲癇的參數[7]為:強度，1 mA;頻率，20 Hz;脈寬，500 μs。(1)行為學觀察時間:刺激30 s，間隔 5 min，持續30 min。(2)電生理觀察時間:刺激30 s。

3.6 檢測指標 (1)首次癲癇大發作潛伏期:從腹腔注射PTZ到出現第1次癲癇大發作的時間。(2)首次大發作持續時間:從腹腔注射PTZ到出現第1次癲癇大發作的時間。(3)行為學評分:根據Racine分級標準[8]進行評分。1分:咀嚼，眨眼、立須等面部肌肉抽搐;2分:以點頭運動為主的頸部肌肉的抽搐;3分:單側前肢的陣攣、抽搐;4分:雙側前肢陣攣、抽搐伴身體立起;5分:雙側后肢強直，身體背曲強直，跌倒伴全身陣攣。其中1-3分為小發作，4-5分為大發作。(4)腦電圖癲癇波的變化:觀察電針刺激抑制癲癇發作的時間，即從刺激后癲癇波被抑制開始到癲癇波恢復到刺激前的時間。

4 統計學處理

數據采用SPSS 13.0統計軟件包進行處理和分析。數據以均數±標準誤(±sE)表示，多組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。

結 果

1 電針耳甲對癲癇大鼠行為學的影響

模型組大鼠腹腔注射PTZ 40 s左右開始出現癲癇發作，開始表現為小發作，如凝視、點頭運動、雙前肢抬起、陣攣等，1-2 min出現大發作，表現為后肢伸直、抽搐、跌倒伴翻滾，PTZ后30 min內大鼠有1-2次大發作，多次小發作。

與模型組比較，耳甲組首次大發作潛伏期延長[(87.13±0.88)s vs(118.88±6.05)s，P ＜0.01];與大椎組比較，耳甲組首次大發作潛伏期延長[(103.50 ±5.63)s vs(118.88 ±6.05)s，P ＜0.05]，見圖1。

Figure 1. The latencies of the first grand mal in the three groups.±sE.n=8.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model group;#P＜0.05 vs Dazhui group.AC:auricular concha.圖1 3組大鼠首次大發作潛伏期比較

與模型組比較，大椎組和耳甲組首次大發作持續時間縮短[(12.00±0.53)s vs(10.25±0.41)s和(9.00±0.53)s，P＜0.05，P ＜0.01];與大椎組比較，耳甲組首次大發作持續時間變化無顯著差異[(10.25±0.41)s vs(9.00±0.53)s，P ＞0.05]，見圖2。

與模型組比較，耳甲組大發作行為學評分減少(4.75±0.16)vs(3.63±0.18)，P＜0.01);與大椎組比較，耳甲組大發作行為學評分減少(4.37±0.18 vs 3.63 ±0.18，P ＜0.01)，見圖3。

Figure 2.Durations of the first grand mal in the three groups.±sE.n=8.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.圖2 3組大鼠首次大發作持續時間比較

Figure 3.The scores of epileptic behaviors in the three groups.±sE.n=8.＊＊ P ＜0.01 vs model group;##P ＜0.01 vs Dazhui group.圖3 3組大鼠行為學積分比較

2 電針耳甲對癲癇大鼠EEG的影響

癲癇波在造模后1-3 min之內開始出現，呈節律性變化，按EEG每出現1次癲癇波記為1次癲癇發作，最初發作3次/min，2 s/次，約7-10 min內持續增多，在約15 min后，呈基本有規律的變化，平均發作約(6.01±0.37)次/min，持續時間(4.28±0.29)s/次，每分鐘發作總的持續時間為(24.95±2.87)s。

與電針大椎比較，VNS和電針耳甲抑制癲癇發作的時間增加[(6.01±0.47)min vs(15.96±0.34)min和(16.80± 0.49)min，均 P＜0.01];VNS和電針耳甲比較，差異無顯著(P ＞0.05)，見圖4、5。

Figure 4.Antiseizure durations in the three groups.±sE.n=8. ＊＊P ＜0.01 vs Dazhui group.圖4 3組刺激抑制癲癇發作時間比較

Figure 5.Antiseizure effects induced by different stimulations.A:Electroacupuncture at“DU 14”suppressed epileptic seizures for 5.91 min.B:VNS suppressed epileptic seizures for 15.52 min.C:Electroacupuncture at AC suppressed epileptic seizures for 16.54 min.Stimulations are indicated by horizontal bars.圖5 3組刺激抑制癲癇效應比較

討 論

PTZ致癲癇模型目前被認為是較理想的急性、全身性發作癲癇模型[9]。PTZ是一種γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)依賴的氯離子通道阻滯劑，主要通過影響與GABA相關的氯離子通道的活性，使GABA釋放減少，抑制功能減弱，使神經元過度興奮，引起癲癇發作。腹腔給予PTZ后1-2 min即可引起動物1-5級的癲癇發作，且發作頻繁，可持續1 h以上[10]。本實驗研究結果與別人報道的結果相吻合，表明此種造模方法成熟可行。

VNS治療癲癇已經得到了臨床驗證[11]。有研究提示，VNS可明顯延長PTZ致癇大鼠癲癇發作的潛伏期，減輕癲癇發作的嚴重程度，減少癇波釋放的頻率[12]。由于VNS是一種有異于生理現象的外界刺激，故亦有一定的不良反應，如聲音嘶啞、咽喉疼痛、咳嗽、氣喘、感覺異常等[3]。迷走神經耳支是迷走神經在體表的唯一分支，經耳迷走神經刺激可能為治療癲癇提供一種更簡單有效的方法[13]。

以往研究[14]表明，VNS有急性預防性作用，即在VNS后短時間內應用癲癇誘發刺激所誘發的癲癇成功率比沒有應用VNS或VNS后很長時間誘發成功率要低很多。本實驗研究結果表明，電針耳甲預處理也具有預防癲癇發作的作用。雖然電生理實驗表明VNS和電針耳甲抑制癲癇的時間差異無顯著，但不能因此斷定VNS和電針耳甲抑制癲癇的效應相似。下一步我們將從實驗和臨床進行此方面的研究。

臨床針灸治療癲癇選穴總的趨勢是以任脈、督脈穴位為主，其中“大椎”為常用穴位。本實驗發現:電針耳甲、“大椎”穴都能改善癲癇大鼠的行為學表現，且電針耳甲效果優于電針“大椎”的效果。Jia等[15]的實驗研究結果表明，電刺激皮質下、神門、枕、腦等耳穴，可以抑制皮層的癲癇皮質腦電圖，改善行為學表現，表明耳穴具有抗癲癇的作用;其所選穴位也大多在耳甲區。由此我們推測，耳針抑制癲癇的效應可能與刺激了迷走神經耳支相關。

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