NAD(P)H:醌氧化還原酶1對多巴胺能細胞的保護作用*

王 艷， 王 娜， 俞國華， 袁崇剛

(華東師范大學生命科學學院，上海200062)

已知帕金森病(Parkinson disease，PD)的主要病因源于黑質多巴胺能神經元的死亡，迄今為止對PD患者多巴胺神經元死亡特異性與漸進性的問題仍沒有完全解決。大量證據表明多巴胺神經元死亡的機制涉及到遺傳學和環境相結合的復雜因素，即:(1)線粒體功能障礙;(2)炎癥過程;(3)氧化應激;(4)蛋白代謝異常。其中，多巴胺能神經元特異性氧化應激引起了人們的高度關注[1，2]。

在氧化環境下，多巴胺可以被氧化形成多巴胺醌。細胞內的NAD(P)H[nicotinamide adenine dinucleotide(phosphate)]依賴還原型輔酶Ⅰ/Ⅱ:醌氧化還原酶[NAD(P)H:quinone oxidoreductase，NQO1]，又稱D2硫辛酰胺脫氫酶(DT－diaphorase)，以NAD(P)H為受體，催化醌類及其衍生物，使其失去2個電子，發生還原反應，其催化特性在于無單電子還原產物半醌及自由基等氧化產物形成，避免了對細胞的損傷。NQO1與其它Ⅰ、Ⅱ相代謝酶一起構成了體內對外源毒性物質的代謝網絡，在機體的解毒代謝中發揮著重要作用[3]。

有實驗證明，Ⅱ相酶誘導劑蘿卜硫素(sulforaphane，SF)在動物機體的各個組織器官內誘導產生Ⅱ相代謝酶，如谷胱甘肽轉移酶(glutathione transferase，GST)和NQO1。Ⅱ相代謝酶可消除有害化學物質，抑制其損傷DNA，從而達到抗癌癥效果[4]。有研究表明，NQO1是一種可誘導的還原酶，當細胞內醌類物質含量升高時，NQO1表達量將會有所增加[5]。NQO1的還原性能夠保護細胞不被自然界中的醌類等生物異源性物質損傷[6，7]。在多巴胺細胞內，多巴胺可以被氧化形成反應性的醌，多巴胺醌可以和蛋白質半胱氨酰基團上的巰基結合，形成醌化蛋白，進而影響蛋白的正常功能[8]。NQO1在多巴胺的自動氧化過程中有保護和抗氧化作用，因而我們認為NQO1應對多巴胺能神經細胞具有保護作用。

在本實驗中，我們運用MTT方法檢測了DA對多巴胺能細胞活性的影響及與醌蛋白形成的相關性，用脂質體轉染方法使細胞內NQO1過表達，并用免疫熒光及免疫印跡法驗證轉染效果，繼而再運用MTT方法檢測DA對NQO1過表達細胞的活性影響。我們的結果揭示了NQO1與多巴胺代謝的關系，并為帕金森病發病機制的研究以及對帕金森病防治提供了新線索。

材料和方法

1 材料

人神經母細胞瘤細胞SH－SY5Y購于中國科學院細胞庫;DMEM/F12培養基均為Gibco產品;新生小牛血清(newborn calf serum，NBCS)為Bio West產品。MTT試劑為上海生博公司產品;多巴胺(dopamine，DA)為Sigma產品;NQO1抗體為Sigma產品;SF為LKT Laboratories產品。β－tubulin抗體為Millipore產品;脂質體轉染試劑GenJetTMin vitro DNA Transfection Reagent為 SignaGen Laboratories產品。氯化硝基四氮唑藍檢測試劑盒為碧云天產品;蛋白濃度測定試劑盒為Bio－Rad產品;紅外熒光Ⅱ抗為Odyssey產品。免疫熒光Ⅱ抗Alexa Fluor 594 goat anti－rabbit IgG為Invitrogen產品。

2 方法

2.1 SH－SY5Y細胞培養方法 SH－SY5Y細胞培養于含有10%新生牛血清的DMEM/F12培養液中，于37℃、5%CO2培養箱中有氧條件下培養[9]。

2.2 細胞增殖分析 SH－SY5Y細胞以3×104cells/well的密度分別接種于24孔板，培養24 h后，加以不同濃度DA，繼續培養24 h后，棄去培養液并加入新鮮培養液，于每孔加入50 μL MTT溶液(5 g/L)，在37℃培養箱中孵育3 h，倒去培養液，每孔加入 200 μL 二甲亞砜 (dimethyl sulfoxide，DMSO)，結晶溶解后將24孔板中的200 μL溶液吸入3個96孔板中，多功能酶標儀檢測570 nm下的吸光度值。NQO1誘導劑SF在細胞種板后2 h加入，然后再過24 h加入DA，測法同前。

加藥方法如下:DA濃度分別為200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L、800 μmol/L、1 000 μmol/L 5 種濃度，每種濃度2個平行孔(24孔板)進行加藥。

2.3 脂質體轉染 接種細胞入10 cm培養皿使其長至80%－90%，轉染前1 h換上新鮮的完全細胞培養液，4個EP管中各加入250 μL DMEM高糖無血清培養基，其中2個EP管中加入12 μL Transfection Reagent，另2個 EP管分別加入4 μg pCB6和4 μg NQO1質粒，然后將含有 Transfection Reagent的培養基迅速加入含有質粒的EP管中，輕輕打勻，室溫培養約15 min，最后將其加入細胞培養皿中，培養12－18 h后換上新鮮完全細胞培養液，然后加藥或進行其它實驗。

2.4 SH－SY5Y細胞的免疫熒光檢測 轉染后細胞內NQO1蛋白的表達情況。將細胞按104cells/well種于24孔板中，以4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3×5 min。加封閉劑于37℃中孵育1 h，吸去封閉劑，加入NQO1抗體(1∶500)，于4℃過夜。PBS漂洗3×5 min，加CY3標記的羊抗兔Ⅱ抗(1∶100)孵育1 h，PBS 漂洗3 ×5 min，再加入核染料 DAPI(4'，6 －diamidino－2－phenylindole)孵育15 min，PBS漂洗3×5 min。熒光顯微鏡下進行觀察。

2.5 Western blotting檢測 細胞裂解抽提蛋白，通過 SDS/PAGE 電泳(50 μg 蛋白/孔)，80 V 電壓30 min，120V電壓1 h 15 min，剝膠后 100V電轉1 h 15 min，Odyssey封閉液封閉1 h，使用以下抗體:兔抗 NQO1(1∶5 000)，鼠抗 β －tubulin(1∶1 000)，4℃振蕩孵育過夜。0.5‰ TBST洗膜3×5 min。OdysseyⅡ抗[抗兔(綠1∶1 000)，抗鼠(紅1∶1 000)]室溫孵育1 h，0.5‰ TBST洗膜3×5 min，PBS洗膜5 min，Odyssey儀器檢測條帶。

2.6 醌蛋白檢測 運用硝基四氮唑藍(nitroblue tetrazolium，NBT)檢測細胞內醌蛋白含量的變化。提取蛋白后，蛋白溶液中加入5倍體積的丙酮沉淀蛋白，室溫放置2 h，3 000×g離心10 min，蛋白沉淀用Guan－HCl溶液(6 mol/L Guan HCl，10 mmol/L Tris HCl，100mmol/L NaH2PO4，pH 8.0)溶解。BCA 蛋白定量后，每 100 μg 樣品與 600 μL NBT/甘氨酸溶液(0.24 mmol/L NBT，2 mol/L 甘氨酸，pH 10)混合，避光搖床反應1 h，酶標儀測定530 nm處的吸光度值。

3 統計學處理

采用SigmaPlot 10.0軟件分析。數據以均數±標準差(±s)表示。單變量配對資料之間的比較采用配對樣本t檢驗。多組間采用單因素方差分析。

結 果

1 MTT檢測DA對細胞的毒性影響，以及NBT檢測DA處理后細胞內醌化蛋白的量

MTT結果顯示，DA對細胞的毒性影響呈現劑量依賴性，隨著DA濃度的升高對細胞的毒性越強，見圖1A，NBT方法檢測顯示細胞經DA處理后，細胞內醌化蛋白含量顯著上升，見圖1B。

2 脂質體轉染NQO1可以減輕DA對細胞的影響

圖2顯示:(1)免疫熒光和免疫印跡法結果顯示，轉染NQO1表達質粒的細胞內NQO1表達量增高，見圖2A、B;(2)MTT結果表明DA對轉染NQO1質粒和轉染空質粒pCB6+的細胞活性影響有明顯差別，轉染NQO1對DA造成的細胞毒性具有顯著的緩解作用，見圖2C。與此同時，NQO1脂質體轉染使細胞內NQO1過表達后，胞內醌化蛋白含量也相應減少，見圖2D。(圖中出現的2條綠色條帶，可能是由于非特異性的染色，對于出現的原因在之后的實驗會繼續探討這個問題。)

3 SF預處理可降低DA對細胞的毒性影響

結果表明:(1)細胞經SF誘導后，可以緩解DA對其造成的細胞毒性影響，見圖3A;(2)免疫印跡法檢測結果表明細胞經DA、SF處理后細胞內NQO1表達量增高，并且DA和SF共同作用使得NQO1表達量進一步提高，見圖3B;(3)加入Ⅱ相酶誘導劑SF使細胞內NQO1過表達后，胞內醌化蛋白含量減少，見圖3C。

Figure 1.DA treatment reduced cell proliferation(A)and increased quinone protein formation(B).SH －SY5Y cells were subject to DA(200 μmol/L，400 μmol/L，600 μmol/L，800 μmol/L，or 1 000 μmol/L)treatment for 24 h.±s.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L DA group.圖1 MTT檢測DA對細胞的毒性影響及NBT檢測胞內醌化蛋白的變化

Figure 2.NQO1 overexpression reduced the toxicity caused by DA in SH －SY5Y cells.A:immunofluorescent staining of NQO1 in SH－SY5Y cells.Cells transfected with an pCB6(left)or NQO1－pCB6(right)plasmids were stained with an anti－NQO1 antibody;B:the level of NQO1 expression was determined by Western blotting with an anti－NQO1 antibody;C:Cells transfected with pCB6 or NQO1－pCB6 plamids were treated with DA for 24 h;D:the content of quinone ptotein was determined by NBT assay.±s.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs pCB6 group.圖2 檢測轉染后細胞內NQO1的變化情況及轉染后DA對細胞的毒性作用

Figure 3.Cell proliferation and NQO1 expression in SF－treated SH－SY5Y cells.A:SF protected cells from DA－induced cytotoxicity;B:NQO1 expression was determined by Western blotting with an anti－NQO1 antibody;C:the content of quinone protein in DA and/or SF－treated cells.±s.n=6.＊＊P＜0.01 vs 600 μmol/L DA;△△P ＜0.01 vs 400 μmol/L DA.圖3 SF預處理細胞后胞內NQO1的表達情況及SF誘導后DA對細胞的毒性影響

討 論

有研究報道Ⅱ相酶誘導劑SF能夠保護多巴胺能細胞不受多巴胺神經毒性劑6－羥多巴胺(6－hydrodopamine，6－OHDA)和四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)的毒性損傷，這些毒性劑會使細胞產生醌類物質，引起細胞內氧化環境發生變化，從而引起細胞選擇性死亡。SF的這種保護作用很可能是由細胞內醌類物質所介導，因為SF作用后，醌氧化還原酶的活性和mRNA提高，而細胞內醌修飾的蛋白降低，同時SF預處理會減輕BH4引起的細胞內活性氧的上升，DNA片段化和脂膜的破壞，這些研究說明SF能夠保護多巴胺能細胞[10]。

DA在正常情況是一種神經遞質，在細胞質中和囊泡內都有分布，但主要是聚集在囊泡中，執行神經遞質的功能。在細胞質中，DA會自氧化或是被酶催化氧化形成多巴胺醌，與細胞內蛋白結合使之失活，進而造成細胞損傷。細胞質中的多巴胺量的增多是多巴胺神經元丟失的原因。有實驗表明DA衍生的醌是作為一個媒介調節蛋白的活性，由于醌缺失電子具有高親核性，對低電位的分子具有很高的反應性，會競爭結合蛋白硫醇基上，從而會引起細胞內蛋白和 DNA 的毒性[11]。

實驗開始首先用MTT方法證明了DA對細胞的劑量依賴性毒性影響。為了研究醌化蛋白與DA造成的細胞毒性的關系，我們用NBT方法檢測了DA處理后細胞內醌化蛋白的含量，結果表明醌化蛋白的含量與DA的細胞毒性具有相關性。細胞內醌氧化還原酶可以還原醌，從而阻止醌化蛋白的產生，因此本實驗對NQO1醌氧化還原酶的作用進行了研究。實驗用脂質體轉染的方法使細胞內的NQO1過表達，繼而運用免疫熒光化學、免疫印跡法方法驗證轉染的效果，確定細胞內NQO1蛋白高表達;在細胞內NQO1過表達之后再用DA作用于細胞，運用MTT方法檢測DA對細胞活性的影響。與轉染空質粒的對照組相比，發現轉染NQO1表達質粒后使得DA對細胞的增殖影響有顯著的緩解作用，并且轉染NQO1表達質粒使細胞內NQO1過表達后，DA處理引起的細胞內醌化蛋白的含量也有所降低。由于NQO1是一種可誘導的還原酶，我們用Ⅱ相酶誘導劑SF預處理細胞，并運用免疫印跡法驗證了細胞內NQO1的表達量提高。隨后，我們檢測了SF預處理對DA細胞毒性的影響，結果表明SF誘導可減輕DA對細胞的毒性，并降低細胞內醌化蛋白的含量。

我們的實驗說明DA對細胞增殖影響與細胞內醌化蛋白的含量有一定關系，此外，細胞內醌氧化還原蛋白NQO1的高表達可以有效減輕細胞內醌化蛋白對細胞的影響，繼而減輕DA對細胞的毒性。帕金森病的主要病理變化是多巴胺能細胞的特異性損傷，其中多巴胺的毒性作用多巴胺能細胞的特異性丟失具有重要作用[12]，所以降低多巴胺醌的形成、減輕醌化蛋白對DA能細胞的損傷對進一步研究和治療帕金森病具有一定的意義。

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