職業苯接觸工人外周血T－bet和GATA－3表達變化的特點*

曾可靜， 李 萡△， 牛宇哲， 劉思初， 陳少華， 楊力建，左璨粲， 孫潤陸， 梁趙佳， 陳嘉榆， 余 衛， 李揚秋

(1暨南大學醫學院血液病研究所，廣東廣州510632;2廣州市第十二人民醫院，廣東廣州510620)

苯在工業上用途很廣，慢性苯中毒是常見的一種職業病。現多項研究已表明苯對機體免疫系統造成損傷，機體免疫功能缺陷表現為對致病性微生物抵抗力下降導致感染性疾病;對機體異常細胞清除能力下降導致腫瘤的發生。免疫功能的下降也必然與免疫應答環節密切相關。有研究表明免疫應答調節的關鍵環節是Th1/Th2分化失衡，其與多種疾病的發生、發展和轉歸有關。而轉錄因子T-bet(T-box expressed in T cells)和GATA-3(GATA binding protein-3)分別作為Th1和Th2細胞特異性轉錄因子受到廣泛關注[1]。T-bet和GATA-3分別特異性地表達于Th1細胞和Th2細胞，并最終影響Th0向Th1/Th2的分化。另外，T-bet與GATA-3均可形成自我激活的反饋調節環路，構成一個動態調節網絡[2]。鑒于目前對接觸苯后細胞免疫狀態了解的不足，我們通過探究外周血中T細胞特異性轉錄因子T-bet和GATA-3 mRNA表達情況，以期為接觸后致血液系統疾病研究提供新的資料。

材料和方法

1 研究對象

采集職業苯接觸工人外周血標本25例，其中女性12名，男性13名，年齡20-62歲，平均(34.5±10.3)歲，工齡0.5-33歲，平均(10.5±9.8)年;慢性苯中毒工人外周血標本27例，其中女性16例，男性11例，年齡19-54歲，平均(35.1±10.9)歲，工齡1-35年，平均(8.2±8.0)年;健康體檢者外周血標本20例，其中女性10例，男性10例，年齡20-57歲，平均(33.9±10.5)歲。苯接觸和慢性苯中毒外周血標本均由廣州市第十二人民醫院提供。苯接觸及慢性苯中毒工人均有職業接觸苯史。接觸苯、苯中毒工人和健康體檢者均無影響造血和免疫功能的基礎疾患、首次就診3個月內未使用影響造血和免疫功能的藥物、無癌癥史、放療及化療史、無其它骨髓毒性化學物接觸史和放射線接觸史。

2 方法

2.1 RNA提取和cDNA合成 按常規方法分離采集肝素抗凝外周血標本中單個核細胞。RNA提取應用Trizol試劑盒(Invitrogen)并應用隨機引物和反轉錄酶試劑(Power ScriptTMReverse，BD)反轉錄合成cDNA第1鏈均按常規方法進行。

2.2 引物設計 GATA-3上游引物5'-TGGCACGGGACACTACCTG-3'，下游引物 5'-TCCCCATTGGCATTCCTC-3，擴增目的片段長度174 bp。T-bet上游引物5'-ATGTGACCCAGATGATTGTGC-3'，下 游 引 物 5'-AAAGATATGCGTGTTGGAAGC-3'，擴增目的片段長度119 bp。EEF內參上游引物5'-ATGTGACCCAGATGATTGTGC-3'，下游引物5'-AAAGATATGCGTGTTGGAAGC-3'，擴增目的片段長度100 bp。引物均由上海生工合成。

2.3 SYBR Green I實時定量PCR 在擴增效率一致性檢測方法建立的基礎上，每一標本分別進行T-bet和GATA-3以及EEF mRNA表達情況檢測。總反應體積為25 μL，包括Real Master Mix 11.25 μL，0.4 mmol/L 上、下游引物1 μL等。95℃ 2 min變性，共進行45個循環擴增，每一循環包括95℃15 s，60℃ 1 min。GATA-3 mRNA在84℃讀板，T-bet在82℃讀板。記錄1次熒光值，獲得熔解曲線。反應在Chromo 4熒光定量PCR儀中進行。

2.4 PCR產物分析 對熔解曲線進行分析，同時進行20g/L瓊脂糖凝膠電泳，以確定產物是否為所擴增的目的片段。

2.5 T-bet和GATA-3 mRNA相對定量分析 采用相對定量法分別分析接觸苯、苯中毒工人與正常人相比較T-bet和GATA-3 mRNA差異表達。以EEF為內參照，利用實時定量PCR獲得的T-bet和GATA-3 mRNA和EEF mRNA Ct值，采用相對定量法(2-ΔCt×100%，ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因)計算苯接觸、苯中毒工人與正常人T-bet和GATA-3 mRNA的相對表達量。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行One-way ANOVA統計分析。數據用均數±標準差(±s)表示。

結 果

1 T－bet和GATA－3表達產物的確定分析

通過瓊脂糖凝膠電泳分析顯示PCR產物片段大小正確。所有標本的EEF mRNA產物熔解曲線峰值均在81℃，正常人T-bet和GATA-3 mRNA產物熔解曲線峰值均分別在82℃和84℃。而個別接觸苯、苯中毒工人T-bet和GATA-3 mRNA產物的熔解曲線則會出現多個不同寬度的峰。

2 苯接觸及苯中毒工人外周血中T－bet和GATA－3表達情況

GATA-3在正常人的表達水平為0.39±0.22，與正常組對照比較職業接觸苯工人組中有19例GATA-3表達水平呈上升趨勢(0.57±0.54)，慢性苯中毒工人組中則有20例GATA-3表達水平呈上升趨勢(0.52±0.50)。此外，在職業接觸苯工人組中發現6例GATA-3表達水平顯著下降(0.15±0.12，P＜0.05)，同樣在慢性苯中毒工人組中也有7例GA-TA-3表達水平顯著下降(0.07±0.06，P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression of GATA-3 mRNA in PBMCs from 20 normal individuals，25 benzene-exposed workers and 27 benzene poisoning workers.N:normal;BEGI:benzene-exposed group with increased expression of GATA-3(n=19);BPGI:benzene poisoning group with increased expression of GATA-3(n=20);BEGD:benzene-exposed group with decreased expression of GATA-3(n=6);BPGD:benzene poisoning group with decreased expression of GATA-3(n=7).*P＜0.05 vs normal.圖1 職業接觸苯和慢性苯中毒患者及正常人PBMCs中GATA－3 mRNA的表達

T-bet在正常人的表達水平為2.15±1.45，與正常組對照比較職業接觸苯工人組中有19例T-bet表達水平呈下降趨勢(1.91±1.49)，在慢性苯中毒工人組27例T-bet表達水平呈下降趨勢(1.52±0.56)。此外，在職業接觸苯工人組中也可發現6例T-bet表達水平顯著上升(3.19±2.10，P ＜0.05)，見圖2。

綜合分析2組樣本中2個基因表達變化特點發現，大部分職業接觸苯和慢性苯中毒工人外周血中GATA-3和T-bet表達模式是GATA-3表達水平上升伴T-bet表達水平下降趨勢。但28%的職業接觸苯工人的GATA-3表達下降伴T-bet表達水平上升相反的趨勢;約22%的慢性苯中毒工人GATA-3表達水平顯著下降。這種雙向表達變化特點在GATA-3中可同時見于苯接觸和苯中毒組樣本，而在T-bet則僅見于苯接觸組。大部分苯接觸和苯中毒工人中T-bet/GATA-3比值分別為4.17±2.17和4.01±2.03，與對照組(6.15±3.73)相比有下降的趨勢。而在6例接觸苯工人T-bet/GATA-3比值(42.7±40.1)呈相反趨勢變化，與對照組相比明顯上升(P＜0.05);同樣7例苯中毒工人的上述2個基因表達水平均下降的T-bet/GATA-3為24.95±14.10，與對照組相比也明顯上升(P＜0.05)。

Figure 2.The expression of T-bet mRNA in PBMCs from 20 normal individuals，25 benzene-exposed workers and 27 benzene poisoning workers.N:normal;BETD:benzene-exposed group with decreased expression of T-bet(n=19);BPTD:benzene poisoning group with decreased expression of T-bet;BETI:benzene-exposed group with increased expression of T-bet(n=6)*P＜0.05 vs normal.圖2 職業接觸苯和慢性苯中毒患者及正常人PBMCs中T－bet mRNA的表達

討 論

苯是目前應用最為廣泛的化工原料和工業溶劑之一。隊列研究證明職業接觸苯人群發生血液淋巴系統惡性疾病的相對危險性明顯增加。吸入苯后的毒性主要與其代謝產物密切相關，有關慢性苯中毒以及苯致再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)、骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes，MDS)和白血病確切發病機制仍不明確。普遍認為是多因素、多水平綜合作用的結果。我們的前期研究發現了苯接觸對于T細胞譜系的分布，T細胞克隆性增殖和胸腺近期輸出功能以及T細胞活化過程都有影響[3-5]。由于T細胞調節的變化同樣影響機體的正常T細胞免疫功能，其調節異常與自身免疫性疾病的發生和腫瘤的發生發展密切相關。本研究進一步分析苯接觸是否對機體Th1和Th2型細胞的平衡產生影響。

T-bet和GATA-3基因所編碼的轉錄因子分別作為Th1和Th2細胞特異性轉錄因子，T-bet和GATA-3失衡與一些疾病，包括自身免疫性疾病的發生及進展有著密切聯系[6]。因此，本研究通過對這2個基因的表達變化分析初步了解苯接觸和苯中毒對Th1和Th2型細胞的平衡的影響情況。研究結果顯示:大部分職業接觸苯和慢性苯中毒工人外周血中GATA-3表達水平上升伴T-bet表達水平下降趨勢。GATA-3表達上升其原因可能與苯代謝產物影響Th2型細胞因子IL-4、IL-5、IL-6 生成增加相關[7]。另一方面，苯接觸或苯中毒后，由于T細胞異常活化，NF-κB的表達變化也可能參與了GATA-3調節表達。在NF-κB缺陷小鼠中，CD4+T細胞不能表達Th2細胞中的GATA-3，但可表達Th1細胞的T-bet和 IFN- γ[8，9]。此外也有研究表明 GATA-3 的表達上調是通過激活Ras/MAPK及calcineurin鈣依賴磷酸酶途徑所致，這兩個途徑的激活又依賴于轉錄因子c-Myb。

而GATA-3和T-bet是兩個相互調節、相互抑制的轉錄因子。T-bet基因表達下降的負調控途徑:(1)GATA-3及STAT-6可抑制T-bet的產生;(2)Th2細胞轉錄因子Jun B對T-bet也存在抑制作用;(3)此外在研究氧化還原失衡對免疫衰老作用的分子機制時發現，過氧化物酶體增殖激活受體 α(peroxisome proliferators-activated receptor alpha，PPARα)通過抑制p38絲裂酶原激酶活性抑制T-bet的轉錄[10]。而有研究證明苯的代謝產物確實可以改變細胞的氧化還原狀態[11]。

大部分苯接觸及苯中毒工人中外周血T-bet/GATA-3比值均低于健康對照，表現為GATA-3高表達伴T-bet表達下降趨勢，這一變化也可以反映其Th1和Th2的變化情況，該變化特點與在腫瘤患者中所發現的Th1和Th2型細胞因子的表達狀況相吻合[12]。腫瘤病人Th2細胞陽性率升高，Th1細胞陽性率降低，Th1/Th2陽性細胞比值降低，同時Th1型細胞因子降低，Th2型細胞因子升高，表現為Th2優勢的漂移狀態。這其中的相關性有待進一步的分析。

另一方面，小部分病人出現了完全相反的GATA-3/T-bet表達模式，提示機體中Th1/Th2的變化與大多數病人完全不同，這種不同的模式，與有關研究中所發現的再障病人中 T-bet和 GAT-3表達異常變化相同[13，14]，是否提示這部分病人與再障的發生存在一定的關聯性，有待進一步對病人的資料進行跟蹤分析。

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