環磷酸腺苷葡甲胺誘導骨髓間充質干細胞向心肌細胞分化的實驗研究*

周 榮， 姚 巍， 李彥紅， 王鳳芝

(山西醫科大學第二醫院心內科，山西太原030001)

誘導骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)分化為心肌細胞一直是干細胞移植治療心臟病的研究熱點[1]。然而，由于這類細胞魚目混珠，其中能真正發揮治療作用的干細胞數量較少且多變，使植入細胞存活數量少，分化率低，致其對心肌梗死和心衰患者的遠期療效受到很大限制。環磷酸腺苷(3'，5'-cyclic adenosine monophosphate，cAMP)作為第二信使在體內發揮重要的生理作用。研究表明cAMP參與調節細胞的增殖與分化，但其作用因細胞類型不同而各異。環磷酸腺苷葡甲胺(meglumine cyclic adenylate，MCA)是環磷酸腺苷類似物，在臨床上主要用于心力衰竭的治療。本研究將MCA加入細胞培養液中干預BMSCs的培養，探討其對細胞活性和心肌特異性基因表達的影響，旨在尋找一種能提高BMSCs存活并促進其分化的干預因子，為在體研究提供相關理論依據。

材料和方法

1 動物

健康Wistar遠交群大鼠，6-7周齡雄鼠，體重160-170 g左右。山西醫科大學實驗動物中心提供。

2 試劑

MCA 購自江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司;PKA抑制劑H89 購自 Sigma;PrimeScript RT reagent kit、SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒購自TaKaRa;兔抗大鼠心肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)IgG購自Santa cruz;大鼠環磷酸腺苷ELISA試劑盒購自RapidBio。5-氮雜胞苷(5-azacytidine，5-Aza)購自Sigma。

3 方法

3.1 BMSCs的分離、培養和鑒定 將大鼠斷頸處死，用75%乙醇浸泡10 min，無菌取雙側股、脛骨，去除附著組織，剪去骨的兩端，接裝有PBS的注射器，反復沖出骨髓至骨體變白。沖出的骨髓吹打成細胞懸液后，以1 500 r/min離心10 min后，棄去上清，在沉淀中加入適量DMEM培養液，吹打成細胞懸液并接種于培養瓶中進行培養。72 h首次換液，以后每2-3 d換液1次。待細胞長滿瓶底的80%以上時，用0.25%胰酶消化，按1∶2或1∶3比例傳代備用。用流式細胞儀檢測BMSCs的表面標志 CD71、CD44、CD45。

3.2 各濃度梯度MCA-細胞培養液的配制 取MCA原液濃度為5.72×10-2mol/L。用細胞培養液配制成濃度分別為1 ×10-2mol/L、1 ×10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L、1 ×10-6mol/L和1×10-7mol/L的MCA細胞培養液。

3.3 MTT比色法 取第3代細胞消化后，用含血清的培養液制成單細胞懸液接種于96孔培養板，加入含6個濃度梯度的MCA細胞培養液，分別培養24 h、48 h。加入MTT(5.0 g/L)10 μL/well、置入培養箱孵育4 h，離心棄上清，加入二甲基亞砜200 μL，采用酶聯免疫檢測儀測定各孔吸光值(A值)。增殖抑制率=1-(實驗孔A值-空白孔A值)/(對照孔A值-空白孔A值)，根據增殖抑制率評價對細胞活性的影響。

3.4 ELISA測定細胞內cAMP水平 取第3代細胞接種于6孔板內，分別給予10-3、10-4、10-5mol/L MCA無血清細胞培養液，于給藥后 2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 收集細胞:吸棄培養液，冰 PBS沖洗1次，加入0.05 mol/L HC1(1010/L)，10 min左右終止反應。待細胞溶解后收集細胞，調整pH值至7.0，4℃、1 200 r/min離心10 min，取上清。按照大鼠環磷酸腺苷ELISA試劑盒說明測定細胞內cAMP水平。

3.5 各濃度MCA誘導BMSCs分化 取第3代細胞接種于6孔板內，分別給予 10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L MCA細胞培養液干預24 h，后換成普通培養液，培養至1周，收集細胞利用熒光定量PCR法測定心肌特異性基因表達情況。

3.6 10-3mol/L MCA作用不同時間對BMSCs分化的影響取第3代BMSCs，待完全貼壁，換成10-3mol/L MCA細胞培養液，分別干預1、3、5、7、9 d。同時給予 10 μmol/L 5-Aza 細胞培養液誘導24 h作為陽性對照和普通培養液作為空白組。各組誘導時間結束后更換為普通培養液，繼續培養至4周，收集細胞。利用熒光定量PCR法測定心肌特異性基因表達情況。

3.7 BMSCs分化率測定 取第3代BMSCs，接種于6孔板內。實驗共分3組:10-3mol/L MCA組、5-Aza組和空白組，培養2周后，采用流式細胞術測定cTnI陽性標記的細胞占細胞總數的百分比。

3.8 PKA抑制劑H89對MCA誘導BMSCs分化的影響 取第3代BMSCs，接種于6孔板內。實驗共分3組:(1)MCA組:給予10-3mol/L MCA的細胞培養液培養3 d;(2)H89+MCA組:給予25 μmol/L H89培養液30 min，再換成 10-3mol/L MCA誘導培養液培養3 d;(3)空白組:給予普通培養液培養。各組誘導時間結束后更換為普通培養液，繼續培養至4周，收集細胞測定心肌特異性基因表達情況。

3.9 熒光定量PCR測定心肌特異性基因表達 提取細胞總RNA，RT反應條件:37℃ 15 min(RT)，85℃ 5 s(反轉錄酶的失活反應)。紫外吸收測定法測定cDNA計算濃度。按組份配制熒光定量PCR反應液，進行real-time PCR反應:擴增程序及參數為:預變性 Reps 1，95℃ 30 s;PCR反應:Reps 40，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30-34 s;Reps 1，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。使用StepOne軟件中的Design Wizard工作流程設計實驗，為實驗輸入設計參數。Applied Biosystems儀器運行實驗。結果判定及計算:(1)熔解曲線:Tm值＞80℃，單峰認為擴增為特異性;(2)相對定量結果計算(2-ΔΔCt法):ΔCt目的基因=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt對照組。引物序列見表1。

4 統計學處理

表1 引物序列Table 1.Sequences for primers

結 果

1 BMSCs生長特性及鑒定

培養1 d后可見到少量細胞貼壁;培養第3 d大部分細胞為梭形或多角形細胞呈貼壁生長;7 d可見散在分布的形態相對均一的梭形細胞，部分排列呈現有規則的集束輻射狀;15 d到20 d細胞基本融合，呈漩渦狀排列，細胞之間界限不清。傳代的細胞形態類似成纖維細胞，生長分布均勻，傳代后細胞增殖速度明顯增快，多次傳代后細胞形態均一，見圖1。流式細胞儀檢測BMSCs表面標志結果顯示:貼壁生長的細胞表達 CD44(98.46%)和 CD71(68.63%)，而不表達CD45(1.24%)，見圖 2。

2 MCA對BMSCs細胞活性的影響

Figure 1.Phase contrast microscopic observation of cultured BMSCs(×200):A，B:primary BMSCs after 2 weeks and 3 weeks，respectively;C，D:passage 3 BMSCs after 24 h and 1 week，respectively.圖1 BMSCs的生長形態

Figure 2.The surface marker of passage 3 BMSCs detected by flow cytometry.CD44 and CD71 were positive，while CD45 was negative.圖2 流式細胞儀檢測BMSCs表面標志CD44、CD71和CD45的表達

隨著MCA濃度的逐漸增大，A490逐漸減小。10-2、10-3、10-4、10-5mol/L濃度組A值與空白組相比差異顯著(P＜0.05);10-6、10-7mol/L濃度組A值與空白組相比無顯著差異(P＞0.05)。通過公式計算細胞增殖抑制率均為負值，表明不同濃度的該藥物對BMSCs的活性呈抑制作用，并表現為時間和劑量依賴性，其中10-2mol/L MCA對細胞的抑制作用尤為顯著，見表2。

3 MCA對BMSCs細胞內cAMP水平的影響

各濃度組在各時點的細胞內cAMP濃度較空白組明顯升高，且隨著MCA濃度的升高，細胞內cAMP濃度也升高。比較各時點cAMP濃度，發現給藥6 h后cAMP濃度達高峰，隨后逐漸下降，至72 h最低，見表3。

4 MCA干預后對BMSCs表達心肌特異性基因的影響

GATA-4、β-MHC和Cx43 mRNA的表達在MCA各濃度組與空白組相比都有所升高(P＜0.05);其中GATA-4、β-MHC mRNA在MCA10-3mol/L組明顯高于其它2個濃度組，差異顯著(P＜0.05)。Cx43 mRNA表達量在MCA 10-5mol/L最高，其次是MCA 10-3mol/L組(P＜0.05)，見表4。

表2 各濃度MCA作用24 h和48 h對BMSCs活性的影響Table 2.The effect of different concentrations of MCA on viability of BMSCs in 24 h and 48 h(±s.n=18)

表2 各濃度MCA作用24 h和48 h對BMSCs活性的影響Table 2.The effect of different concentrations of MCA on viability of BMSCs in 24 h and 48 h(±s.n=18)

*P＜0.05 vs blank group;#P＜0.05 vs MCA 10-2mol/L group.

Group 24 h 48 h Blank 0.569±0.077 0.687±0.035 MCA 10-2mol/L 0.481±0.039* 0.485±0.017*MCA 10-3mol/L 0.502±0.017*# 0.521±0.013*#MCA 10-4mol/L 0.515±0.042*# 0.546±0.014*#MCA 10-5mol/L 0.539±0.049*# 0.554±0.012*#MCA 10-6mol/L 0.551±0.015 0.574±0.019 MCA 10-7mol/L 0.561±0.025 0.591±0.044

表3 各濃度MCA在各作用時點BMSCs細胞內cAMP水平Table 3.The cAMP level in BMSCs treated with different concentrations of MCA at different time points(nmol/L.±s.n =6)

表3 各濃度MCA在各作用時點BMSCs細胞內cAMP水平Table 3.The cAMP level in BMSCs treated with different concentrations of MCA at different time points(nmol/L.±s.n =6)

*P ＜0.05 vs blank group.

Group 2 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h MCA 10-3mol/L 32.12±0.47* 47.27±0.34* 37.19±0.33* 34.41±0.24* 33.43±0.20* 30.01±0.39*MCA 10-4mol/L 22.29±0.39* 33.02±0.30* 28.86±0.25* 28.73±0.21* 21.95±0.56* 19.73±0.36*MCA 10-5mol/L 15.87±0.35* 27.21±0.42* 26.03±0.31* 25.32±0.19* 20.28±0.36* 15.06±0.27*Blank 5.34±0.17 5.84±0.12 5.41±0.34 5.32±0.31 5.38±0.16 5.65±0.42

表4 各濃度MCA對BMSCs心肌特異性基因表達的影響Table 4.Expression of myocardium-specific genes after different concentrations of MCA induced BMSCs into myocardium(±s.n=6)

表4 各濃度MCA對BMSCs心肌特異性基因表達的影響Table 4.Expression of myocardium-specific genes after different concentrations of MCA induced BMSCs into myocardium(±s.n=6)

*P＜0.05 vs blank group;#P＜0.05 vs MCA 10-4mol/L group and 10-5mol/L group.

Group GATA-4 mRNA β-MHC mRNA Cx43 mRNA Blank 0.86±0.46 0.65±0.38 0.83±0.19 MCA 10-3mol/L 33.08±1.77*#22.98±6.36*# 7.51±0.61*MCA 10-4mol/L 4.79±0.63* 14.32±4.34* 3.98±1.31*MCA 10-5mol/L 2.56±0.32* 7.95±2.71* 12.19±0.42*

5 MCA作用不同時點心肌特異性基因的表達

10-3mol/L MCA作用3 d和5 d的2組在培養4周時GATA-4、β-MHC、Cx43 mRNA表達量高于其它3組(P＜0.05)。其中MCA誘導3 d組略高于誘導5 d組，見表5。

表5 10－3mol/L MCA誘導不同時點BMSCs心肌特異性基因的表達Table 5.Expression of myocardium-specific genes after 10-3 mol/L MCA induced BMSCs into myocardium in different time points(±s.n=6)

表5 10－3mol/L MCA誘導不同時點BMSCs心肌特異性基因的表達Table 5.Expression of myocardium-specific genes after 10-3 mol/L MCA induced BMSCs into myocardium in different time points(±s.n=6)

*P＜0.05 vs 1 d group;#P＜0.05 vs 7 d and 9 d group;▲P＜0.05 vs 5 d group.

Induction time Cultured 4weeks GATA-4 mRNA β-MHC mRNA Cx43 mRNA 1 d 49.12±3.17 42.22±3.77 19.93±1.43 3 d 74.69±4.36*# 65.44±4.04*#▲ 30.12±2.19*#▲5 d 70.18±3.05*# 59.88±3.12*# 25.45±1.56*#7 d 62.62±3.55* 40.76±3.16* 17.70±2.42*9 d 57.36±5.16* 39.68±2.94* 10.75±4.11*

6 MCA和5－Aza對BMSCs分化作用的比較

MCA組、5-Aza組與空白組相比，GATA-4、β-MHC和Cx43 mRNA的表達增高;GATA-4和β-MHC mRNA在MCA組較5-Aza組的表達量增多(P＜0.01)，見表6。流式細胞儀測定誘導分化率:MCA組誘導分化率略高于5-Aza組的誘導分化率(20.24% ±1.02%vs 18.39% ±0.58%，P＜0.05)。

7 給予PKA抑制劑H89對心肌特異性基因表達的影響

MCA組與空白組相比GATA-4、β-MHC和Cx43 mRNA的表達量顯著增加(P＜0.01);給予H89后，H89+MCA組GATA-4、β-MHC和Cx43 mRNA的表達量較MCA組顯著減少(P＜0.01);GATA-4、β-MHC和 Cx43 mRNA這3種基因在H89+MCA組也有所表達，并且與空白組相比有顯著差異(P＜0.01)，見表7。

表6 比較MCA和5－Aza誘導BMSCs后心肌特異性基因的表達情況Table 6.Expression of myocardium-specific genes after MCA or 5-Aza induced BMSCs into myocardium(±s.n=6)

表6 比較MCA和5－Aza誘導BMSCs后心肌特異性基因的表達情況Table 6.Expression of myocardium-specific genes after MCA or 5-Aza induced BMSCs into myocardium(±s.n=6)

*P＜0.05 vs blank group;#P＜0.05 vs 5-Aza group.

Group GATA-4 mRNA β-MHC mRNA Cx43 mRNA Blank 0.69±0.51 0.86±0.12 1.31±0.19 MCA 51.31±2.33*# 30.94±2.13*# 15.80±1.39*5-Aza 35.48±2.24* 19.06±1.54* 11.86±1.02*

表7 給予PKA抑制劑H89干預MCA誘導BMSCs后心肌特異性基因的表達情況Table 7.Expression of myocardium-specific genes with PKA inhibitor H89 treatment after MCA induced BMSCs into myocardium(±s.n=6)

表7 給予PKA抑制劑H89干預MCA誘導BMSCs后心肌特異性基因的表達情況Table 7.Expression of myocardium-specific genes with PKA inhibitor H89 treatment after MCA induced BMSCs into myocardium(±s.n=6)

*P＜0.05 vs blank group;#P＜0.05 vs MCA group.

Group GATA-4 mRNA β-MHC mRNA Cx43 mRNA MCA 33.08±1.27* 30.94±2.13* 15.80±1.39*H89+MCA 15.63±0.64*# 10.46±1.13*# 4.46±0.62*#Blank 0.86±0.46 0.65±0.38 1.14±0.74

討 論

BMSCs能夠分化為心肌細胞早已被國內外學者所認識，并有大量國內外研究證實其能分化為心肌細胞[2]，分化的細胞具有相似的動作電位和形成閏盤結構[3]。但是BMSCs移植中存在一些影響治療效果的問題，如移植細胞存活率低、分化率低。目前公認的能誘導BMSCs分化為心肌細胞的化學誘導劑是5-Aza，其誘導分化率最高也僅30%，但是其有毒不能用于在體的誘導分化[4]，因此大批的學者致力于探究能用于人體的、提高BMSCs定向分化因素的研究[5]。

cAMP是體內重要的第二信使，參與細胞的代謝、生長、分化和凋亡等[6]。經典的 cAMP主要是通過蛋白激酶 A(protein kinase A，PKA)信號通路發揮作用。研究已證實cAMP/PKA信號轉導通路能促進心肌早期轉錄因子GATA-4[7，8]和連接蛋白 Cx43的表達。GATA-4是干細胞向心肌細胞分化的重要啟動因素[9]，參與調節心肌細胞結構基因和相關調控基因的表達。Cx43具有非通訊功能，可調節細胞的生長、增殖、分化、凋亡等生物學過程[10]。研究表明增加細胞內cAMP的水平能促進Cx43的磷酸化，增加Cx43的表達以及調控Cx43的細胞間通訊[11]。MCA是環磷酸腺苷類似物，葡胺作為配基與cAMP結合，可增強cAMP的脂溶性，使cAMP易于通過細胞膜，提高細胞內cAMP濃度，使cAMP的作用得到充分的發揮[12，13]。基于以上的理論依據，本課題從細胞水平研究MCA對BMSCs向心肌細胞分化的影響，以期為提高干細胞移植的臨床療效提供新思路和靶點。

本實驗觀察到隨著MCA濃度的逐漸增大，細胞活性逐漸減少，說明該藥物對BMSCs的活性呈抑制作用。在抑制細胞活性的過程中，沒有觀察到細胞死亡現象。MCA抑制BM-SCs活性表現為時間和劑量依賴性。研究表明MCA能夠通過細胞膜進入BMSCs細胞內，升高細胞內cAMP的濃度，且呈濃度依賴性。研究發現經MCA干預后BMSCs心肌特異性基因GATA-4、β-MHC和Cx43表達增多，表明MCA具有誘導BMSCs向心肌樣細胞分化的能力。深入研究其量效關系，可見10-3mol/L濃度的MCA誘導干預3 d能發揮最佳的誘導分化作用。同時研究中也發現不是誘導的時間越長誘導效果越好，這可能與環磷酸腺苷對細胞分化的復雜作用有關。目前公認的化學誘導劑為5-Aza，因此我們選用5-Aza作為陽性對照，運用熒光定量RT-PCR法比較心肌特異性基因表達量和流式細胞術測定兩者干預后BMSCs表達心肌特異性cTnI的陽性細胞率，可見MCA組表達量和陽性細胞略高于5-Aza組，再一次說明MCA有誘導分化的作用，且這種作用略強于5-Aza。

cAMP對細胞的生物效應主要是通過激活PKA來實現。PKA屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過磷酸化調節多種蛋白質，包括轉錄因子的活性，對細胞分化和生長起著調節作用。經典的cAMP/PKA信號轉導通路為:cAMP→依賴cAMP的蛋白激酶A(PKA)→基因調控蛋白→基因轉錄。目前有關cAMP/PKA通路與干細胞向心肌細胞的分化沒有受到關注，更沒有與臨床應用藥物相結合。有報道[14]在培養基中加入不同濃度的cAMP與胚胎干(embryonic stem，ES)細胞共同培養，能增加搏動細胞的數量，RT-PCR分析顯示ES細胞在經與cAMP聯合培養后能表達心肌細胞特異性標記物GATA-4、NKX2.5、β-MHC和ANF。但在這項研究中沒能就誘導分化的機制進行深入探討。

H89是一種常用的PKA抑制劑，可以通透細胞，選擇性抑制cAMP依賴的蛋白激酶PKA、PKG和PKCμ，但對于PKA的選擇性抑制作用更強。本研究中給予H89作用30 min后，再用MCA誘導，發現心肌特異性基因GATA-4、Cx43和β-MHC mRNA表達明顯減少;雖然有H89的抑制作用，但是仍發現BMSCs還能少量表達GATA-4、Cx43和β-MHC mRNA，說明H89能部分抑制MCA的誘導分化的作用，這與cAMP除了主要通過cAMP/PKA信號通路發揮作用，還可通過其它信號通路(如ERK通路)發揮作用有關，這些相關信號通路的作用有待深入研究。

從以上結果，我們可以推論MCA可以進入BMSCs內，升高細胞內cAMP水平，主要通過cAMP/PKA信號通路發揮誘導分化作用。至于BMSCs分化為心肌細胞的具體機制尚需深入研究。

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