養陰清熱法對放療后食管癌大鼠c-myc蛋白表達和細胞凋亡的影響*

洪永貴，黃 濤，鄭玉玲，王俊生

1)安陽市腫瘤醫院內科安陽455000 2)黃河科技學院醫學院鄭州450005 3)河南中醫學院鄭州450008

(2010-12-23收稿 責任編輯 姜春霞)

食管癌放療后，中醫病機則以陰津不足、熱邪內留為主，痰淤互結為輔，治療上當以養陰清熱為主，輔以化痰散結、祛淤解毒。作者選用放療后大鼠食管癌模型，以養陰清熱立法，應用地黃管食通口服液治療，探討養陰清熱法對放療后食管癌大鼠細胞凋亡及相關蛋白c-myc表達的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用Wistar大鼠，體質量(120±10)g，2個月齡，雌雄各半，由河南省實驗動物中心提供，合格證號:0001645。在該中心清潔級(SPF)環境下常規飼料(消毒后)喂養。

1.2 實驗藥品 甲基戊基亞硝胺(MANA)由華西醫科大學提供，用玉米油配成體積分數0.2%的液體。地黃管食通口服液(以下簡稱管食通，為鄭玉玲教授經驗方，主要由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓、冬凌草和山豆根等組成):10 mL/支，河南中醫學院第一附屬醫院制劑室提供，含生藥比例為1-1。實驗濃度依次為低劑量含生藥0.5 kg/L(為臨床用藥劑量的10倍)、中劑量含生藥1.0 kg/L、高劑量含生藥1.5 kg/L，均為混懸液。六味地黃丸(由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓等組成):河南宛西制藥股份有限公司生產，批號:050114，臨床用量9 g/d，用羧甲基纖維素鈉配成含生藥0.45 kg/L的混懸液(為臨床用藥劑量的30倍)。戊巴比妥鈉:上海第一制藥廠生產。鹽酸氯胺酮注射液:上海第二制藥廠生產。

1.3 主要試劑和儀器 鼠抗c-myc單克隆抗體為Santa Cruz公司產品，批號G2205;免疫組織化學試劑盒為美國 Zymed公司產品，批號50181263(鼠抗);DAB顯色試劑盒，批號50281313，購于北京中杉金橋生物技術有限公司。細胞凋亡檢測試劑盒為華美生物工程公司產品，批號106055。DT-300A型電子天平，上海醫用激光儀器廠;雙目光學顯微鏡和顯微照相機，日本Olympus公司;Co60照射治療機，上海醫療設備廠生產;DQP-9001電腦切片機，上海醫用儀器廠。

1.4 動物模型的建立、分組及給藥 健康Wistar大鼠130只，按隨機數字法抽取20只作為空白對照組(空白組)。其余110只動物均皮下注射MANA 5 mg/(kg·d)，1次/周，連續20周，末次注射MANA后，按隨機數字法抽取20只大鼠作為食管癌造模組(食管癌組)，并將空白組、食管癌組每組隨機選取2只，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(1 g/kg，4 mL/kg)處死。取食管縱切置于40 g/L多聚甲醛緩沖液固定后，石蠟包埋，常規制片，HE染色，食管癌組抽取大鼠經病理學檢查均證實為食管癌，造模成功。剩余90只造模大鼠經氯胺酮腹腔注射麻醉［0.1 g/(kg·d)，2 mL/(kg·d)］，應用 Co60放射治療機進行大鼠食管局部照射，劑量為2 Gy/d，共5 d。末次照射24 h后，將放療動物隨機均分為5組，單放組［蒸餾水10 mL/(kg·d)］、六味組［六味地黃丸4.5 g/(kg·d)］、低劑量組［地黃管食通口服液5 g/(kg·d)］、中劑量組［地黃管食通口服液10 g/(kg·d)］和高劑量組［地黃管食通口服液15 g/(kg·d)］，各組動物每周測體質量，根據體質量變化調節給藥劑量。實驗結束，所有大鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(30 mg/kg)處死，行相關檢查。放療后用藥期間，食管癌組和單放組各有2只大鼠死亡，六味組有1只死亡;管食通各組均無大鼠死亡。

1.5 檢測指標 所有標本離體后1 h內采集，取大鼠咽至胃的食管切成縱條，每例標本經40 g/L多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規切片制片，用SP法測定cmyc蛋白表達以及TUNEL法檢測細胞凋亡，并計算凋亡指數。c-myc表達的測定主要步驟:常規脫蠟至水，體積分數3%H2O2甲醇溶液消除內源性過氧化物酶，高壓修復抗原，滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，不洗;滴加一抗 c-myc，4℃過夜，PBS漂洗，滴加二抗37℃20 min，滴加S-A/HRP 37℃20 min，DAB顯色，蘇木素輕度復染，透明封片，顯微鏡觀察。結果判定標準:c-myc蛋白陽性反應均位于細胞核或細胞質內，均呈棕黃色顆粒，每張切片觀察5個200倍視野，每個視野計數500個細胞，根據顯色有無及陽性細胞多少可分為4個等級。陰性(－)，整個切片未見陽性染色;弱陽性(+)，陽性細胞數＜25%;中度陽性()，陽性細胞數25% ～50%;強陽性()，陽性細胞數＞50%。TUNEL法主要步驟:石蠟切片梯度乙醇脫蠟至水和蛋白酶K室溫濕化，滴加TUNEL反應混合液，DAB顯色，蘇木素輕度復染，封片，顯微鏡觀察。全部操作按試劑盒說明書操作。結果判定標準:凋亡細胞核呈棕黃色;每張切片觀察5個200倍視野，每個視野計數500個細胞，計算凋亡細胞百分比，即為凋亡指數(apoptotic index，AI)。

1.6 統計學處理 采用SPSS 13.0進行統計分析。各組c-myc表達水平的比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗;AI比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組大鼠c-myc蛋白表達情況 空白組僅見散在細胞核棕色著染，且顏色較淡;食管癌組大多數細胞核呈棕黃色，著色深，尚可見棕褐色的細胞核;中劑量組胞核呈棕黃色，著色明顯比食管癌組淺。見圖1和表1。

2.2 各組大鼠細胞凋亡檢測結果 空白組可見少數細胞核棕色著染，大部分細胞核呈淺藍色;食管癌組僅見散在細胞核呈棕黃色，著色淺;中劑量組胞核呈棕黃色，著色明顯較深。見表2和圖2。

圖1 各組大鼠c-myc蛋白表達情況(SP，×200)A:空白組;B:食管癌組;C:中劑量組。

表1 各組大鼠c-myc表達比較 例

表2 各組大鼠AI比較

圖2 各組大鼠細胞凋亡情況(TUNEL，×200)A:空白組;B:食管癌組;C:中劑量組。

3 討論

細胞凋亡最早由Kerr等［1］提出，是為維持內環境穩定由基因控制的細胞程序性死亡。腫瘤的發生與細胞凋亡有密切關系。很多抗癌藥是通過誘發腫瘤凋亡來發揮作用的。

c-myc是一個具有多種功能的癌基因，位于人的第8號染色體上，編碼2個磷酸蛋白(P62和P67)，定位于線粒體內水溶性蛋白質，穩定地結合于線粒體內膜，不能通過內膜［2］，是參與正常細胞增殖、轉化和分化的一個原癌基因，能調控細胞周期，具有誘導增殖和凋亡的雙重作用［3］，在腫瘤的發生及轉移等過程中可發揮重要作用，是與食管病變程度相關的蛋白之一［4］。近年有學者［5］開展了c-myc與核糖體蛋白反饋調控的研究，確認核糖體蛋白L11是m-cyc的負反饋調控物，可以抑制細胞內c-myc的轉錄活性，作為轉錄因子，myc有與大量基因組座位結合的能力［6］。李晟磊等［7］認為c-myc過度表達可能是食管癌發生發展過程中的早期事件，對食管癌患者預后的判斷有重要參考價值。吳名耀等［8］通過觀察70例食管癌切除新鮮標本的上切緣正常黏膜、癌旁食管黏膜上皮和食管原位癌組織中hTERT和c-myc蛋白的表達情況，認為癌旁黏膜上皮c-myc的上調促進了hTERT的表達。

依據養陰清熱法組方的地黃管食通口服液主要用于治療食管癌放療中或放療后患者，經多年應用，能減輕放射線的不良反應，并與放療起協同作用［9］。

該實驗結果顯示，c-myc蛋白表達，與空白組比較，高劑量組差異無統計學意義;與食管癌組比較，地黃管食通口服液各組差異均有統計學意義;與單放組比較，只有高劑量組差異有統計學意義。各組均見有細胞凋亡，且放療組和各藥物治療組與空白組及食管癌組比較差異均有統計學意義;六味組與單放組、低劑量組比較差異均無統計學意義;地黃管食通中劑量組及高劑量組與單放組和六味組比較差異均有統計學意義;中劑量組與低劑量組比較差異均有統計學意義，高劑量組與中劑量組及低劑量組比較差異均有統計學意義。

綜上所述，養陰清熱法(地黃管食通口服液)可降低食管癌放療后大鼠c-myc蛋白表達水平，并能誘導腫瘤細胞凋亡，提示其防治食管瘤放療后復發的機制可能是通過降低c-myc表達水平，誘導腫瘤細胞凋亡所實現。

［1］ Kerr JF，Wyllie AH，Currie Ar.Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetic［J］.Br J Cancer，1972，26(4):239

［2］ Dai MS，Jin Y，Gallegos JR，et al.Balance of Yin and Yang:ubiquitylation-mediated regulation of p53 and c-myc［J］.Neoplasia，2006，8(8):630

［3］ Junttila MR，Westermarck J.Mechanisms of MYC stabilization in human malignancies［J］.Cell Cycle，2008，7(5):592

［4］王立東，任景麗，宋昕，等.食管癌變過程中腫瘤相關蛋白的表達［J］.鄭州大學學報:醫學版，2009，44(1):13

［5］ Dai MS，Lu H.Crosstalk between c-Myc and ribosome in ribosomal biogenesis and cancer［J］.J Cell Biochem，2008，105(3):670

［6］ Kim J，Chu J，Shen X，et al.An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells［J］.Cell，2008，132(6):1049

［7］李晟磊，崔晶，陳俊濤，等.c-myc和p27在食管鱗狀上皮癌變過程中的表達及其意義［J］.新鄉醫學院學報，2004，21(3):168

［8］吳名耀，吳賢英，莊楚香.hTRT和C-myc的表達在食管上皮增生和癌變過程中的意義［J］.癌變·畸變·突變，2003，15(1):17

［9］鄭玉玲，王新杰.放療聯合地黃管食通口服液治療食管癌的臨床觀察［J］.中國中醫藥信息雜志，2003，10(8):47