豫南地區漢族人群類風濕性關節炎患者TNF-α基因啟動子－308 G/A多態性檢測*

宋新強，汪學群，易朝輝，鄭 健，韓俊剛，劉承麗，張亞可，彭玉玲，馬 云

1)信陽師范學院生命科學學院信陽464000 2)信陽市第一人民醫院風濕免疫科信陽464000 3)信陽職業技術學院信陽464000

(2010-11-28收稿 責任編輯 趙秋民)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關節滑膜慢性炎癥為主的自身免疫性疾病，其病因及發病機制尚未完全明確，遺傳和環境因素都有可能導致該病的發生與發展［1］。一部分遺傳因素來自于人類主要組織相容性復合體(HLA)Ⅱ類基因，也有研究［2］表明，HLAⅢ類基因的一些區域也與RA的易感性有關。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)基因位于 HLAⅢ類基因區，由4個外顯子和3個內含子組成，含有許多多態性位點，包括微衛星DNA和單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)。到目前為止，已經發現有 14個 SNP位點(－1031 T/C，－863 C/A，－857 C/T，－851 C/T，－419 G/C，－376 G/A，－308 G/A，－244 G/A，－238 G/A，－163 G/A，－49 G/A，+489 G/A，+851 A/G，+1304 A/G)和6個微衛星位點［3］。目前，已有關于TNF-α基因SNPs與RA的相關性研究，但是，很多結論卻完全相反［4-7］。作者以豫南地區人群作為研究對象，分析TNF-α基因啟動子－308 G/A多態性與RA發生、發展之間的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 RA組90例，其中女60例，男30例，均為漢族，年齡 18 ～75(33.5 ±3.2)歲，為信陽市第一人民醫院2008年至2010年住院及門診確診的患者，病程5個月～15 a。診斷符合美國風濕病協會(ACR)1987年診斷標準，其中無侵蝕性病變者32例，有侵蝕性病變者58例。正常對照100例，女60例，男40例，均為漢族，年齡18～60(34.2±4.6)歲，為信陽師范學院校醫院門診體檢健康者。

1.2 標本采集及基因組DNA的提取 抽取受試者外周血2 mL，加EDTA抗凝后－20℃冰凍保存。用酚/氯仿抽提法提取基因組 DNA，其 A(260nm)/A(280nm)為1.6 ～1.8，使用時 DNA 終質量濃度為100～300 μg/L。

1.3 TNF-α－308 G/A 的PCR-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)分析 根據文獻［8］設計引物，上游引物序列:5’-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3’，下游引物序列:5’-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3’。PCR反應體系(50μL):10×PCR Buffer 5μL，dNTPs 4 μL，Taq 酶 0.25 μL，模板 DNA 8 μL，引物各1μL，雙蒸水30.75μL。PCR反應條件:94℃預變性4 min;94℃變性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸50 s，循環30次;72℃延伸5 min。取PCR產物13 μL，加10×Buffer 2 μL，NcoⅠ酶1 μL，100 mg/L牛血清白蛋白2μL，雙蒸水2μL，總體積20μL，37℃過夜(12 h)。酶切產物采用25 g/L瓊脂糖凝膠電泳，結果用凝膠分析系統分析。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0進行分析，應用χ2擬合優度檢驗檢測RA組與對照組基因型頻率的分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。用χ2檢驗、精確概率法或校正χ2檢驗比較2組基因型頻率和等位基因頻率以及有無侵蝕性病變患者等位基因的分布，并以比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區間(CI)表示相對風險度。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 正常對照組TNF-α 基因啟動子(χ2=6.750，P=0.009)和 RA 組－308 位點(χ2=19.401，P ＜0.001)基因型頻率均不符合Hardy-Weinberg平衡。

2.2 TNF-α基因啟動子 －308 G/A PCR-RFLP 結果 TNF-α基因啟動子－308位點檢出3種基因型，酶切產物分別包含87、20 bp 2條條帶GG型，107、87、20 bp 3條條帶(GA型)和僅有107 bp條帶(AA型)。見圖1。2組基因型及等位基因頻率的比較見表1。RA組有、無侵蝕性病變患者間TNF-α基因啟動子－308位點等位基因頻率比較，見表2。

圖1 NcoⅠ酶切 TNF-α基因啟動子－308位點PCR擴增產物1，4:GA型;2:GG型;3:AA型。

表1 RA組與正常對照組TNF-α基因啟動子－308位點基因型和等位基因頻率 例(%)

表2 RA組有、無侵蝕性病變患者TNF-α基因啟動子－308位點等位基因頻率分布 例(%)

3 討論

實驗［9］表明，在RA患者血清和滑膜液中都能檢測到TNF-α與白細胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-13、IL-15、IL-17、TGF-β 等，提示細胞因子參與了RA的發病過程。動物實驗［10-11］也暗示，TNF-α的高表達加快了RA的發病過程。

有研究［4］結果顯示RA的易感性與TNF-α啟動子－308位點A等位基因有關，另有研究［5］顯示RA與G等位基因有關，或者兩者都與RA無關［6-7］。作者的實驗結果顯示豫南地區漢族人群TNF-α基因啟動子－308位點G/A多態性與RA發病無關，但與RA的疾病發展程度相關。Cvetkovic等［9］的實驗表明，在伊朗東北部城市麥什德，TNF-α基因啟動子－308位點GA雜合子患者更易發生RA;Wilson等［4］的實驗也表明，在荷蘭的奈梅亨GA基因型更易發展為侵蝕型RA;而Brinkman等［5］報道稱，在荷蘭西部城市萊頓未發現－308位點GA型與RA的疾病發展程度相關，卻發現－238 GG型與RA疾病發展程度相關。作者的實驗結果顯示，TNF-α基因啟動子－308位點G等位基因與RA的嚴重程度有關。

綜上所述，TNF-α基因啟動子－308 G/A多態性可能與豫南地區漢族人群RA無關，但可能與關節的侵蝕性病變有關。

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