重組纖維連接蛋白誘導自體CIK聯(lián)合IFN-α治療晚期肝癌療效*

徐本玲，袁 龍，高全立，范瑞華，張成娟，宋永平

1)鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院中心實驗室鄭州450008 2)鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院普外科鄭州450008 3)鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院生物治療科鄭州450008

(2010-12-23收稿 責任編輯 趙秋民)

肝癌在我國是一種常見的惡性腫瘤，占惡性腫瘤死亡率的第二位，其預后差，非切除的姑息性治療5 a生存率不到10%［1-2］。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells，CIK)的抗腫瘤效果已經(jīng)在許多動物實驗和臨床試驗中得到證實［1，3］。鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院采用重組纖維連接蛋白(retronectin，RN)誘導自體CIK聯(lián)合干擾素-α(interferon-α，IFN-α)治療晚期肝癌，并評價此方法的可行性及臨床應用效果，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 一般資料 收集2009年1月至2010年12月就診于鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院的復發(fā)難治的Ⅲ、Ⅳ期肝癌患者14例，中位年齡55(41～78)歲，男10例，女4例。所有患者均被組織病理學明確診斷為肝癌，乙肝表面抗原陽性，均有可測量病灶，預計生存期≥3個月;Karnofsky評分≥60，血常規(guī)正常(白細胞計數(shù)≥4.0×109L－1，淋巴細胞計數(shù)≥0.8×109L－1，血紅蛋白≥100 g/L，血小板計數(shù)≥100 ×109L－1)，心、肺、肝、腎功能正常，無嚴重伴隨疾病。該研究得到鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會的批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 自體CIK的制備 抽取患者外周血50 mL，經(jīng)人淋巴細胞分離液密度梯度離心獲得外周血單個核細胞(PBMC)，懸浮于含體積分數(shù)為2%自體血漿的GTT-551(TaKaRa公司)無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)當天加入重組人IFN-γ(1 000 U/mL)，24 h后轉(zhuǎn)入經(jīng)5 mg/L RN和抗CD3單克隆抗體(mAb)包被過的培養(yǎng)瓶中，加入IL-2(500 U/mL)，在37℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第4天將刺激后的細胞轉(zhuǎn)入GTT610培養(yǎng)袋中，同時補充體積分數(shù)為2%自體血漿的無血清培養(yǎng)基，以后每3 d補加新鮮培養(yǎng)基，同時補加IL-2(500 U/mL)。培養(yǎng)第10、15和20 d分別測定細胞表型并行細胞計數(shù)。細胞回輸前5 d抽取20 mL培養(yǎng)液進行細菌真菌檢測，回輸當天進行內(nèi)毒素檢測和細胞表型分析。

1.3 治療方法 所有患者接受4～6次自體RN誘導的CIK細胞治療，每周1次，每次回輸后如無不良反應則繼續(xù)完成以后的治療。每次回輸?shù)腃IK細胞不少于5×109，CD3+CD56+的細胞比例不低于20%。14例患者均同時接受1周3次的3×106IU/次的IFN-α的治療。此外，有9例患者在回輸CIK的同時接受IL-2(1×106IU/d，共5 d)和胸腺肽α1(1.6 mg/d，共 5 d)治療。

1.4 觀察指標 ①監(jiān)測治療中和治療后局部或全身的毒副反應，毒副反應分級按照世界衛(wèi)生組織標準評估。②檢測治療前后患者外周血AFP，用流式細胞術(shù)檢測免疫功能變化情況。③采用BDTM-CBA Human Th1/Th2型細胞因子試劑盒(美國BD公司)檢測治療前及療程結(jié)束后7 d外周血IFN-γ、腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)和 IL-4的變化。④治療結(jié)束后1個月，以后每3個月行CT、超聲及MRI等進行療效評估。參照 WHO實體瘤療效判定標準，以完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)及進展(PD)進行療效評定，臨床獲益=CR+PR+SD。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0進行分析，應用配對t檢驗比較培養(yǎng)前后細胞的免疫表型特征、治療前后患者外周血淋巴細胞亞群、臨床獲益和無反應患者治療前后外周血細胞因子的變化，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CIK細胞的體外分析 經(jīng)過15 d的培養(yǎng)，細胞處于對數(shù)生長期，細胞活性均在97%以上，CD3+CD56+的細胞占 15.9%(14.8% ～ 17.3%)，CD3+CD8+的細胞占 74.5%(61.5% ～79.6%)，故取培養(yǎng)15 d的CIK細胞用于回輸。

2.2 毒副作用 所有患者均很好耐受，1例首次回輸CIK后3 h出現(xiàn)發(fā)熱(38℃)，未經(jīng)處理，5 h后體溫恢復正常。應用IFN-α和IL-2后8例患者出現(xiàn)2度發(fā)熱，給予消炎痛栓后得以控制。治療中及隨訪過程中均未見局部和全身明顯毒副作用，患者肝腎功能治療前后未見明顯變化，未見骨髓抑制。

2.3 療效評價 14例患者共接受64次CIK細胞的回輸，回輸細胞數(shù)平均25.6×109(21.6×109～31.8×109)。AFP下降3例，無明顯變化4例，升高7例。14例患者中無CR病例，1例PR，4例SD(其中2例患者的AFP水平有明顯下降)，9例PD，臨床獲益率達35.7%。4例SD患者分別在隨訪到7、8、10、10個月時病情進展。

2.4 CIK治療前后患者外周血中的細胞亞群和細胞因子分析 不管是臨床獲益的患者還是無反應患者，淋巴細胞數(shù)均有明顯升高(表1、2)。治療后臨床獲益患者血清IFN-γ和TNF-α水平較治療前升高(表3)，而在無反應患者細胞因子的分泌則無明顯變化(表4)。

表1 臨床獲益患者治療前后外周血淋巴細胞亞群分析(n=5) ×106 L－1

表2 無反應患者治療前后外周血淋巴細胞亞群分析(n=9) ×106 L－1

表3 臨床獲益患者治療前后外周血細胞因子的變化(n=5) ng/L

表4 無反應患者治療前后外周血細胞因子的變化(n=9) ng/L

3 討論

CIK是一群增殖率髙并具有抗腫瘤活性的異質(zhì)細胞，通過穿孔素/顆粒酶殺傷腫瘤細胞，此外，自然殺傷細胞表面受體NKG2D和淋巴細胞功能相關(guān)抗原1黏附受體(lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1)的激活也有助于CIK識別和殺傷腫瘤細胞［4-6］。

為了保證受者和公眾的安全，防止感染性試劑(異體血清等)通過細胞治療產(chǎn)品進行傳染是非常重要的，同時也為了盡量保證CIK的一致性，無血清培養(yǎng)是一種理想的制備細胞治療產(chǎn)品的方法，但卻又面臨制備的細胞數(shù)量不足的障礙。作者選用RN參與誘導CIK，獲得的CIK一致性較好，培養(yǎng)到第15天左右時CIK的主要效應細胞CD3+CD56+細胞所占比例均在15%以上，CD3+CD8+細胞所占比例均在60%以上，細胞活性在96%以上，細胞數(shù)量均可達到5×109，可以滿足臨床需要。CIK回輸后，所有患者均耐受性好，未見明顯不良反應。

Olioso等［7］將CIK用于復發(fā)難治的霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肝癌及腎癌等的治療，均取得了令人鼓舞的效果。在該研究中也觀察到，采用RN刺激的自體CIK聯(lián)合IFN-α治療晚期肝癌，1例獲PR，4例SD，臨床獲益率達35.7%。臨床獲益患者和臨床無反應患者回輸?shù)腃IK的數(shù)目和次數(shù)均無明顯差異，但在治療后臨床獲益患者外周血中Th1類細胞因子(IFN-γ，TNF-α)明顯高于治療前，而治療無反應患者治療前后細胞因子的分泌無明顯變化。

總之，RN誘導的自體CIK聯(lián)合IFN-α治療晚期肝癌取得了較好的療效，也對其他實體瘤的臨床治療有一定的借鑒作用。

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