噬菌體生物擴增法檢測結核分枝桿菌氧氟沙星耐藥性研究

王慶 徐東芳

（安徽省結核病防治研究所 合肥 230022）

耐多藥結核病（MDR－TB）是新世紀結核病控制面臨的嚴峻挑戰之一［1]。對于耐多藥的治療需通過藥物敏感性實驗選擇有效的藥物，氟喹諾酮類藥物包括氧氟沙星（Ofloxacin，OFX）因其良好的抗結核活性，成為目前治療耐藥結核病廣泛應用的二線藥物之一［2]。但常規耐藥性檢測方法時間太久，嚴重滯后臨床治療的需要。因此，快速準確的氧氟沙星耐藥性檢測技術對臨床治療及控制結核病具有重要的意義。噬菌體生物擴增法（phage amplified biologically assay，PhaB）是一種新型的表型技術，可快速診斷結核病和結核的藥物敏感性，一般不超過4d就得知藥敏結果，本文應用噬菌體生物擴增法對205株結核分枝桿菌氧氟沙星的耐藥性檢測，并與常規使用的絕對濃度法藥敏結果進行比較，對不一致菌株進行WHO推薦的比例法測定，以評價PhaB檢測結果的敏感度、特異度、準確度、陽性預測值和陰性預測值。現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 噬菌體及其檢測試劑 均為上海市肺科醫院結核病重點實驗室惠贈，具體見文獻［3] 。

1.1.2 藥物及其濃度 OFX藥粉購自Sigma公司，用0.4%NaOH溶解后，再用無菌蒸餾水配制為1mg／ml，－20℃保存，PhaB法應用時稀釋至16μg／ml。

1.1.3.試 菌 株 H37Rv 標 準 菌 株 （ATCC 95054）購自中國疾病預防控制中心結核病防治臨床中心國家菌種保藏中心，205株MTB臨床分離株均為本實驗室庫存菌株，全部來自我院確診的肺結核患者的痰標本培養物，并經常規生化反應鑒定為MTB。檢測前，將待檢菌株轉種至改良羅氏培養基37℃培養2～3周。檢測時，刮取菌落少許，磨菌后用液體培養基調整濁度至1個麥氏單位，相當于1mg／ml，1∶500稀釋后待檢。

1.2 方法

1.2.1 PhaB法 按相關參考文獻［4] 的方法進行，但有以下不同。吸取1∶500稀釋的待檢菌液0.2ml，加入16μg／ml OFX 0.2ml（OFX終濃度為8μg／ml），對照管加0.2ml液體培養基，混勻后置37℃培養72h；各管加0.1ml噬菌體，37℃溫育1h；各管再加0.1ml殺毒劑（噬菌體滅活劑），充分混勻，室溫作用5min；各管混合物分別加入提前倒入平板的5ml液體培養基和1ml指示細胞混勻，加入5ml溶化的瓊脂（日本進口分裝），旋轉混勻，37℃培養18～24h后觀察噬菌斑形成情況。分別計算每個菌株的加藥管與對照管的噬菌斑減少百分比。以加藥管與對照管的噬菌斑減少百分比≥90%判為敏感，反之為耐藥。每次實驗均以H37Rv標準株作為對照。

1.2.2 絕對濃度法和比例法測定OFX耐藥性按中國防癆協會制定的《結核病診斷細菌學檢驗規程》［5]配制羅氏OFX藥敏培養基進行常規的絕對濃度法和比例法OFX耐藥性檢測，絕對濃度法藥物濃度分別為3、10μg／ml，比例法的藥物濃度為2μg／ml，每次實驗均以H37Rv標準株作為對照。

2 結果

2.1 檢測方法學研究

2.1.1 藥物濃度和作用時間選擇 采用終濃度為1、4、8、16μg／ml系列梯度稀釋的OFX，分別與結核分枝桿菌OFX敏感株和耐藥株作用24、48和72h，然后進行噬菌體檢測。結果表明在OFX終濃度為8μg／ml時，無論作用24、48和72h，耐藥株均出現大量噬菌斑；而敏感株作用24和48h均有噬菌斑，作用72h后無噬菌斑，因此選擇OFX終濃度為8μg／ml，藥物作用時間為72h。

2.1.2 穩定性試驗 采用同樣的測定條件，1d內對3株OFX耐藥株和3株敏感株檢測2次，連續5d，觀察測定方法的穩定性。結果表明，每次檢測敏感株均判斷為敏感，耐藥株均判斷為耐藥。此外，無藥對照管的噬菌斑數量基本相似。

2.2 臨床菌株的OFX耐藥性測定結果 采用PhaB法檢測205株結核分枝桿菌臨床分離株OFX耐藥性，并與常規絕對濃度法藥敏結果進行比較，結果見表1。以絕對濃度法藥敏結果為判斷標準，則PhaB法測定OFX耐藥性的敏感性為95.4%（83／87），特異性為 93.2%（110／118），陽性預測值為91.2%（83／91），陰性預測值為96.5%（110／114），準確性為94.1%（193／205）。2種藥敏方法比較χ2＝0.75＜χ0.052＝3.84，顯示PhaB法與絕對濃度法測定OFX耐藥性結果差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 噬菌體法與絕對濃度法測定OFX耐藥性結果（株）

2.3 不一致菌株的氧氟沙星比例法測定 12株PhaB法與絕對濃度法測定OFX耐藥性結果不一致的菌株，通過比例法耐藥性監測，其中4株PhaB法測定為OFX敏感而絕對濃度法測定為耐藥的菌株中，有3株（75%）比例法測定為敏感，1株（25%）比例法為耐藥，在8株PhaB法測定為OFX耐藥而絕對濃度法敏感的菌株中，比例法測定耐藥6株（75%）、敏感2株（25%），結果見表2。

表2 噬菌體法與絕對濃度法測定OFX耐藥性不一致的菌株比例法結果 株

3 討論

分枝桿菌噬菌體在1947年首次分離，至今已分離出250余種［6]。近年來，分枝桿菌噬菌體在結核病快速診斷及耐藥性測定中的研究報道逐漸增多［7]。該方法的基本原理是分枝桿菌噬菌體能感染活的結核分枝桿菌，如待檢菌株為耐藥株，則可正常生長，并被噬菌體感染，噬菌體在感染的菌體內得到保護，不會被隨后加入的殺毒劑殺死（而敏感株因被藥物殺死，噬菌體無法進入菌體內，而被隨后加入的殺毒劑殺死）。噬菌體在感染的菌體內大量繁殖，并將菌體裂解，釋放出的噬菌體可立即感染隨后加入的指示細胞，噬菌體使指示細胞裂解，在培養皿上出現肉眼可見的噬菌斑。因此，只要根據噬菌斑的有無即可判斷待檢菌株的耐藥性。

耐藥濃度的界定是要以已建立的標準方法及臨床評估方法取得最高一致率的原則而確立的。在本研究中將OFX的耐藥臨界濃度界定為8μg／ml和作用時間為72h是通過預試驗選定的，該耐藥臨界濃度檢測結核分枝桿菌耐藥性時與絕對濃度法取得最大一致性。國外關于PhaB法檢測氧氟沙星的相關報道較少，國內楊華等［8]對氧氟沙星抗結核分枝桿菌的臨床耐藥界限的研究建議16μg／ml是較理想的耐藥臨界濃度，而我們采用了8μg／ml，可能原因是培養基不同，我們采用的是改良的羅氏培養基，而楊華等采用的是7H9液體培養基。本研究中，PhaB法對205株結核分枝桿菌臨床分離株進行OFX藥敏試驗結果顯示，以絕對濃度法藥敏結果為判斷標準，敏感度為 95.4%（83／87），特異度為93.2%（110／118），陽性預測值為91.2% （83／91），陰性 預 測 值.96.5% （110／114），總 符.率 為94.1%（193／205）。與國內黃學銳等［9]的結果相比，較為一致。另外，對噬菌體法與絕對濃度法測定OFX耐藥性結果不符的12株菌株，我們采用了WHO／IUATLD全球結核病耐藥監測項目推薦的比例法進行耐藥性檢測，該方法具有較高的穩定性，可重復性高特點。實驗結果表明其中的9株噬菌體法檢測結果與比例法相符，符合率為75.0%（9／12），12株的噬菌體法與絕對濃度法結果不一致，矛盾出現的可能原因有：一是在結核分枝桿菌復合群的亞培養株中耐藥株占的比例增高或者代謝活性的改變，對藥物己不敏感，造成假陽性；二是絕對濃度法可能因方法上的缺陷如菌量接種誤差導致測定結果不準，也可能是這兩種方法判定標準的不同導致的差異，標準的不同對結果影響很大，可能會得到相反的結論。且絕對濃度法目前雖然是我國推薦的常規藥敏方法，但OFX作為二線藥物，藥敏測定的濃度至今尚無參考依據，使羅氏藥敏測定OFX耐藥性存在不足，也會導致測定結果不準確。

綜上所述，噬菌體生物擴增法測定OFX耐藥性確有較高的敏感性和特異性，不需要特殊儀器設備、經濟安全等特點，有可能成為耐藥結核病的實驗室快速診斷方法之一。但我們在檢測過程中體會到應注意以下幾點：（1）每次實驗必須設全各種對照，如陰性對照、陽性對照和殺毒劑對照等以保證檢測結果的可靠性；（2）加入殺毒劑后一定要徹底搖勻，以殺死全部未進入菌體里的噬菌體；（3）澆注平板時瓊脂的溫度為55℃，不宜過高，以免滅活噬菌體；（4）避免操作污染，以防影響結果觀察。

［1] Smith KC，Armitige L，Wanger A.A review of tuberculosis：reflections on the past，present and future of a global epidemic disease［J] .Expert Rev Anti Infect Ther，2003，1（3）：483－491.

［2] 何國鈞，肖和平.抗結核藥物的研究進展［J] .中華結核和呼吸雜志，2000，23（10）：621－625.

［3] 胡忠義，倪蓮娣，靳安佳，董惠賢，鐘敏，李建農，翁心華.噬菌體生物擴增法快速檢測結核分枝桿菌方法學研究［J] .中華結核和呼吸雜志，2004，27：801－805.

［4] 王潔，崔振玲，胡忠義，張瀅蓉，樂軍，張文宏，翁心華.噬菌體法同時檢測四種一線抗結核藥物耐藥性［J] .中華傳染病雜志，2006，24（2）：102－105.

［5] 中國防癆協會基礎專業委員會.結核病診斷細菌學檢驗規程［M] .北京：中國教育文化出版社，2006：34.

［6] McNerney R.TB：The return of the phage.A review of fifty years of mycobacterio phage research［J] .Int J Tuberc Lung Dis，1999，3：179－184.

［7] 王慶，金玉蓮，李建農，柴華，孫道霞，包訓迪.四種方法檢測結核分枝桿菌耐藥性結果的比較及方法評價［J] .中華傳染病雜志，2007，25：690－694.

［8] 楊華，王潔，周新剛，崔振玲，陸俊梅，胡忠義.噬菌體生物擴增法和最低抑菌濃度法檢測結核分枝桿菌氧氟沙星耐藥性［J] .中華臨床醫師雜志，2007，4：21－24.

［9] 黃學銳，高微微，張旭霞，王甦民，潘毓萱，馬玙.氧氟沙星和左氧氟沙星抗結核分枝桿菌臨床耐藥界限的研究［J] .中華結核和呼吸雜志，2004，27（2）：84－88.