應用基因芯片方法檢測結核分枝桿菌利福平和異煙肼的耐藥性

張俊仙 吳雪瓊 陽幼榮 梁艷

眾所周知,耐多藥結核病已經嚴重影響了全球結核病的控制和治療。耐多藥結核病是指結核患者至少對利福平和異煙肼2種最主要的一線抗結核藥物耐受。然而,由于結核分枝桿菌(Mycobacteriu m tuberculosis,Mtb)是慢生長分枝桿菌,常規的藥敏試驗需4～8周的時間,因此結核患者通常不能得到及時、有效的治療,導致耐多藥結核患者結核菌的增殖和傳播。因此,需要建立一種操作簡便、快速的藥物敏感性試驗方法,這對于控制耐多藥結核病的傳播具有重要的意義。

近年來出現很多耐藥性檢測的新方法,如PCR-單鏈構象多態性(PCR-Single Strand Conformation Polymorphism,PCR-SSCP)、PCR-限制性片段長度多態性(PCR-restrition fragment length polymophism,PCR-RFLP)、DNA 測序法、分子燈塔法、噬菌體生物擴增法等,都因為各種各樣的問題難以在臨床上廣泛推廣。筆者應用PCR-基因芯片和基因測序方法對30株利福平和異煙肼敏感株和50株利福平和異煙肼耐藥株進行檢測,以期為耐多藥結核病的檢測提供簡單、快速、有效的方法。

材料與方法

一、菌株來源

80株Mtb臨床分離株由本室保存,已按全國結核病細菌學檢驗標準化規程進行菌種鑒定證實為Mtb,并根據傳統藥敏試驗結果選擇30株利福平和異煙肼敏感株、50株耐利福平和異煙肼分離株。Mtb標準株H37Rv來自中國藥品生物制品檢定所。

二、試劑和儀器

Mtb耐藥檢測試劑盒(芯片法)購自北京百奧瑞生物技術有限公司。PCR擴增儀和 LuxScan 10K-B微陣列芯片掃描儀等均為博奧生物有限公司提供。

三、細菌DNA的制備

采用本室自制的標本前處理試劑盒提取DNA,置-20℃保存備用[1]。

四、PCR擴增

按試劑盒說明書進行。每管PCR反應體系總體積為20 μ l,其中 Mtb分離株 DNA 模板為2 μ l,PCR擴增試劑1、PCR擴增試劑2和PCR擴增試劑3各 18 μ l。PCR產物1為對照產物,與兩種微陣列都進行雜交。PCR產物2為rpoB基因的擴增產物,與利福平微陣列相對應;PCR產物3為katG基因及inhA基因啟動子的擴增產物,與異煙肼微陣列相對應。PCR擴增程序為：37℃600 s,94℃600 s;94℃30 s,60℃30 s,72℃40 s,35個循環;然后94℃30 s,72℃60 s,10個循環;最后置 72℃420 s。

五、基因芯片

檢測探針和對照探針各重復5個點,每行1～5和6～10分別為同一個探針,利福平相關rpoB基因的探針排布示意見表1。異煙肼相關katG基因和inhA基因啟動子的探針排布示意見表2。

六、芯片雜交和結果判讀

根據試劑盒說明書進行操作。簡而言之,每管含雜交緩沖液9 μ l,分別加入同一樣品的PCR產物1和 PCR產物2各 3 μ l,或者加入 PCR產物 1和PCR產物3各3 μ l。置于PCR擴增儀中于95℃變性5 min,然后冰浴 3 min;將13.5μ l雜交反應混合物經蓋片的加樣孔加入,迅速蓋上雜交盒并密封;放入50℃預熱的恒溫水浴鍋中120 min;水平取出雜交盒,拆開取出芯片,洗滌后離心甩干。置LuxScan 10K-B微陣列芯片掃描儀中讀取信號、判讀結果。

表1 利福平相關rpoB基因的探針排布

表2 異煙肼相關katG基因和inhA基因啟動子的探針排布

七、PCR-直接測序法

根據Mtb序列,用軟件Oligo 6.0設計利福平上下游測序引物rpoB3、rpoB4,可擴增rpoB基因產生240 bp片段,其中包括507～533位密碼子之間81 bp熱點區間的序列。設計異煙肼上下游測序引物 katG 1、katG2和 inhA1、inhA2,可分別擴增katG基因和inhA基因產生273 bp和255 bp片段,分別包括常見的katG基因315位密碼子和inhA基因啟動子-15位突變。擴增產物經2%瓊脂糖電泳,均為陽性,說明沒有基因缺失。擴增產物送上海生工生物工程公司進行基因測序。

結 果

一、芯片雜交結果

PCR-芯片雜交結果見表3。30株Mtb利福平敏感株rpoB基因、異煙肼敏感株katG基因和inhA基因芯片雜交結果與Mtb標準株結果一致,均為Mtb野生型。

50株Mtb耐利福平分離株中,7株芯片雜交為野生型;42株有單位點突變,1株有雙位點突變。以80株Mtb臨床分離株藥敏檢測結果為判斷標準,芯片檢測的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確率分別是 86.00%(43/50)、100.00%(30/30)、100.00%(43/43)、81.08%(30/37)、91.25%(73/80)。43株耐藥突變株中,28株(65.12%)為 rpoB基因 531位突變,其中 26株TCG→T TG突變,2株 TCG→TGG突變;6株(13.95%)為526位突變,其中4株CAC→TAC突變,1株CAC→CGC突變,1株CAC→GAC突變;4株(9.30%)516位突變,2株GAC→GTC突變,2株GAC→TAC突變;3株(6.97%)511位突變,均為CTG→CCG突變;1株(2.33%)513位CAA→AAA突變;1株(2.33%)雙位點突變為 511位CTG→CCG和516位GAC→GGC突變。部分芯片雜交結果見圖1。

表3 50株利福平和異煙肼耐藥株PCR-基因芯片檢測與基因測序結果

圖1 Mtb利福平rpoB基因部分芯片雜交圖

50株Mtb異煙肼耐藥株中,14株芯片雜交均為野生型,36株有katG和/或inhA突變,芯片檢測的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、準確率分別.72.00%(36/50)、100.00%(30/30)、100.00%(36/36)、68.18%(30/44)、82.50%(66/80)。31株芯片檢測有katG突變的分離株中,30株315位AGC→ACC突變和1株315位AGC→AAC突變;7株芯片檢測有inhA突變的分離株均為-15位C→T突變;其中2株既有katG突變又有inhA突變。部分芯片雜交結果見圖2。

二、PCR-直接測序結果

結果見表3。30株Mtb利福平和異煙肼敏感株DNA測序結果與基因芯片檢測結果一致,均為Mtb野生型。

圖2.tb異煙肼katG基因和inhA啟動子芯片雜交圖

50株Mtb耐利福平分離株中,44株基因測序結果與PCR-基因芯片檢測結果一致,其中3株均為rpoB野生型,41株均為突變型。6株基因測序結果與PCR-基因芯片檢測結果不一致,其中4株為單位點突變,芯片上無相應的探針(分別是531位TCG→TAG、515位 ATG→ATA、513位 CAA→CAT和522位TCG→CAG);2株測序結果為雙位點突變,其中各有1個突變位點芯片上無相應的探針,分別是516位GAC→AAC、526位CAC→CAG 突變。

50株Mtb耐異煙肼分離株中,47株katG基因測序結果與 PCR-基因芯片檢測結果一致,其中16株均為野生型,31株均為315位密碼子突變;3株katG基因測序結果與 PCR-基因芯片不一致,芯片上無相應的探針,分別為299位GGC→GTC突變、322位ACG→GCG突變和 291位 GCT→GAT突變。37株inhA基因測序結果與PCR-基因芯片檢測結果一致,其中30株均為野生型,7株均為-15位突變型;13株inhA基因測序結果與PCR-基因芯片檢測結果不一致,芯片上無相應的探針,其中10株為68位G→A突變,3株分別為-8位T→C、-21位G→C和-17位G→T突變。

討 論

目前的研究表明,大約95%以上的Mtb耐利福平分離株在RNA聚合酶β亞單位編碼基因rpoB的507-533位密碼子的81bp熱點區域有突變[2],90%的點突變發生在該區域11個氨基酸密碼子之一的部位,其中最常見的突變位點是531位、526位和516位,并且531＞526＞516[3-5]。而Mtb耐異煙肼主要與katG基因和inhA啟動子突變有關,katG基因最常見的突變是315位密碼子AGC→ACC的突變,該突變引起過氧化氫酶活性降低,導致異煙肼耐藥[6]。InhA基因編碼脂肪酸轉運蛋白(NADH依賴的enoyl-ACP還原酶),是分枝菌酸細胞壁合成的必需成分,活化的異煙肼結合到NADH上抑制了依賴NADH酶的活性,抑制了分枝菌酸的合成而導致了細胞的死亡。inhA基因的突變修改了該酶,使它失去了和NADH的親和力,導致異煙肼耐藥[7-8]。因此,這些區域是利福平和異煙肼耐藥株分子檢測的主要靶位[9-11]。

基因芯片技術是目前分子診斷的先進方法。國內外很多專家分別報道用基因芯片檢測耐利福平Mtb標本,其檢測結果與測序結果大多數相符[12-13]。因此,應用基因芯片快速檢出rpoB基因、katG基因和inhA基因突變可以作為耐多藥結核病的診斷指標。

本研究應用已商品化的基因芯片分析Mtb rpoB基因的6個野生型和13個突變型位點,分析katG基因315位密碼子的1個野生型和2個突變型及inhA基因啟動子區-15位的野生型和突變型,因此,可檢出耐多藥結核病常見的基因突變位點。

本實驗中30株Mtb利福平和異煙肼敏感株中,DNA芯片雜交結果也均為野生型,特異度為100.00%。50株耐利福平臨床分離株中43株可檢測到rpoB基因突變,靈敏度為86.00%,與郭乃洲等[14]報道的一致。這是因為該基因陣列探針只包括最常見的13種突變,基因測序結果證明4株突變株芯片上無相應的突變探針,因此,基因芯片檢測的靈敏度低于基因測序。此外,3株在分析的部位未發現基因突變,有可能在本檢測范圍外的其他位點存在突變,或者是存在其他耐藥機制,或者傳統藥敏實驗誤差所致。本試驗中,檢測到的最常見的突變位點也是531位、526位和516位密碼子,與報道一致。

50株Mtb耐異煙肼分離株中,36株有katG和(或)inhA突變,靈敏度為 72.00%,其中katG 基因突變率為62%,與袁瑛等[15]、菅記涌等[16]報道的一致;inhA-15位基因突變率僅為 14%,與Morris等[17]報道的一致。由于芯片只能檢測到常見的野生型和突變型,因此,katG基因測序顯示的3株少見的突變基因型芯片未能檢出。此外,16株在分析的部位未發現基因突變,筆者將進一步分析,查找原因。

在耐異煙肼分離株中,通過PCR-基因芯片只檢出7株inhA-15位C→T突變,但基因測序發現10株芯片檢測敏感的菌株存在inhA 68位G→A突變,該突變為首次報道,它在異煙肼敏感菌株中不存在,但在測序證實的20株inhA基因突變株中,該突變基因型占了50%,高于inhA-15位突變,該突變是否與異煙肼耐受相關尚需進一步研究證實。

總之,用PCR-基因芯片可快速、特異地檢測出大多數Mtb耐多藥分離株,用于臨床耐藥性檢測,可指導臨床治療。

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