發光二極管熒光顯微鏡在基層應用的多中心研究

夏輝 趙冰 李強 歐喜超 王勝芬 趙雁林

痰涂片顯微鏡檢查在結核病防治工作中對于發現傳染源、診斷、療效評價等具有重要作用。目前我國大部分地區使用萋尼染色法（簡稱Z－N法），其成本低廉、特異度較高，但靈敏度較低。熒光染色方法靈敏度較Z－N法能夠提高約10%，且特異度與之相當［1]。然而，普通汞蒸汽燈泡熒光顯微鏡成本高、燈泡使用壽命短（200～300h左右）、需要專門的暗室等限制了其推廣使用。發光二極管在熒光顯微鏡中的使用降低了熒光顯微鏡的成本。盡管國內外有一些關于熒光染色發光二極管熒光顯微鏡（簡稱LED）檢測方法的研究，但其在我國縣（區）級實驗室應用的可靠性、可行性等尚沒有進行系統評估。本研究對內蒙古自治區呼和浩特市賽罕區和林格爾縣，江蘇省淮安市淮陰區、楚州區，湖南省長沙市寧鄉縣、常德市桃源縣等6個縣（區）級實驗室LED的使用情況進行系統評估，為LED在中國基層推廣使用提供實踐經驗。

材料和方法

1.研究對象：收集2009年12月至2010年6月間6個結核病防治機構（簡稱結防機構）就診的初診肺結核可疑癥狀者及正接受治療的隨訪肺結核患者，共納入6208例（痰標本11288份），其中3691例為初診可疑癥狀者（6809份痰標本），2509例為隨訪患者（痰標本4467份），8例（12份標本）沒有記錄初診或隨訪。初診可疑癥狀者中29.78%（1099／3691）收 集 3 份 痰 標 本，46.79%（1727／3691）的患者僅收集1份痰標本，其余患者收集2份痰標本；隨訪患者中79.71%（2000／2509）收集2份痰，20.01%（502／2509）收集1份痰標本，極少數患者收集3份或以上份痰標本。

2.試驗方法：每份痰標本制作2張涂片，分別由2名實驗室人員用Z－N和LED法進行染色和鏡檢，鏡檢過程嚴格質量控制。

Z－N法染色采用石碳酸復紅熱染5min，LED法采用金胺O冷染15～20min。Z－N法使用1000×鏡觀察（100×物鏡、10×目鏡），LED法在400×鏡下觀察（40×物鏡、10×目鏡），具體染色方法及報告標準參見文獻［2] 。

3.試劑和材料：Z－N和LED法采用試劑均為商品化試劑（珠海貝索生物技術有限公司，Z－N試劑批號為410021和410042，熒光試劑批號為410021和410051）。發光二極管熒光顯微鏡為Primo star發光二極管熒光顯微鏡（蔡司公司）。

4.統計分析：所有數據統一錄入Epidata數據庫，用SPSS 15.0軟件進行分析。兩率之間的比較采用卡方檢驗，兩樣本均數間比較采用t檢驗，P＜0.05認為有統計學意義。

5.質量控制：所有參與研究的人員均接受了統一培訓，并進行熟練度測試。各項目點使用統一供應試劑。負責兩種方法的實驗員獨立盲法進行實驗操作。

6.倫理學：本研究由中國疾病預防控制中心、美國帕斯適宜衛生科技組織及香港公共衛生檢測中心倫理委員會評審通過。

結 果

1.Z－N與LED法陽性涂片檢出率比較：總納入患者、初診可疑癥狀者及隨訪患者中使用LED法較Z－N法的陽性涂片檢出率均有提高，且均具有統計學意義（P＜0.05）（表1）。若不將鏡檢結果是實際條數（Z－N法：1～8條／300視野；LED法：1～9條／50視野）判斷為陽性，則Z－N法和LED法的陽性檢出率分別為7.97%（900／11288），和8.93%（1008／11288），后者較前者增加0.96%。

表1 6個實驗室不同來源標本2種鏡檢方法痰涂片陽性檢出率比較

各實驗室2種方法在總患者、初診可疑癥狀者及隨訪患者中痰涂片陽性檢出率的具體情況見表1。初診可疑癥狀者中陽性檢出率提高幅度最大達11.74%，最小僅0.30%，除3號實驗室外其他實驗室2種方法陽性涂片檢出率差異均有統計學意義（P＜0.05）；而在隨訪患者中，2個實驗室使用LED與Z－N法檢出率持平，除4號實驗室有13.79%的提高外，其他實驗室的提高幅度在0.76%～1.65%之間。

2.Z－N與LED法鏡檢結果分布差異分析：11288張涂片使用Z－N和LED法檢測有2.91%（328／11288）存在定性差異。其中，Z－N 法為陰性的涂片有311張LED法判為陽性，其中有73.63%（229／311）被判讀為1～9條／50視野；相反，LED法為陰性的有10張涂片被Z－N法判為1～8條／300視野（表2）。

3.讀片時間比較分析：使用Z－N法的平均讀片時間［（206.31±75.86）s] 明顯較LED法［（120.03±38.88）s] 長（t＝28.12，P＝0.00）。其中，陰性結果使用LED法的平均時間較Z－N法短89.04s（t＝30.47，P＝0.00）；陽性結果使用LED法的平均時間［（82.11±53.71）s] 較Z－N法［約（134.79±93.66）s] 節省52.68s（t＝4.39，P＝0.00）。2種方法閱讀不同陽性級別涂片所花費的時間見表3。

討 論

本研究采用多中心研究方法評估了LED法在我國縣（區）級實驗室應用情況。結果顯示LED法的陽性涂片檢出率較Z－N法無論是在初診還是隨訪患者中均有提高，提示使用LED法不僅可以提高涂陽患者發現率，對療效判斷也會有較大影響。Steingart等［1]通過回顧多篇文章發現，熒光染色傳統熒光顯微鏡較Z－N法陽性檢出率增加值范圍多數在0%～3%，但是其中幾項研究陽性檢出率增加值高達19%～33%，故平均陽性檢出率提高為9%（95%CI：5%～13%）。本研究結果Z－N法陽性涂片檢出率范圍為4.33%～11.96%，LED法陽性涂片檢出率范圍為5.06%～24.26%。LED法較Z－N法陽性檢出率增加值范圍為0.35%～12.79%。各縣（區）結果差異較大，與各地肺結核疫情、患者就診時間是否延遲、實驗室操作技術等均有關聯。

表2 Z－N和LED法鏡檢結果分析（單位：份）

表3 不同涂片結果在兩種方法中的讀片時間分析

Z－N和LED法存在定性差別的涂片中60%以上來自于某一實驗室。國家參比實驗室對此實驗室LED法涂片鏡檢的203張涂片（其中15張陰性，181張結果為“1～9條／50視野”和7張“1＋”）進行了Z－N法復檢，結果顯示，雖然該實驗室省級熒光顯微鏡復檢與縣級LED法結果有較高的一致性（粗一致率約88.18%），但縣級檢測為“1～9條／50視野”的181張涂片中僅6張被Z－N法復檢為陽性，其余175張全部判斷為陰性，占96.69%。此實驗室LED法初檢和使用傳統熒光顯微鏡復檢結果一致性較好；但用脫色后使用Z－N法復檢，大部分實際條數的涂片被判為陰性結果，可能有以下幾方面原因：（1）由于涂片結果本身是低陽性級別，含菌量少，在重新脫色和復染過程中少量菌丟失致使再次復檢時判為陰性結果。（2）Z－N法對低陽性級別結果涂片判讀本身存在一定局限性。（3）使用LED法在菌量較少情況下對菌的形態不容易辨認，因為無論是縣（區）級還是省級以往均沒有很多熒光鏡檢方面的經驗，所以可能在判斷時發生誤差。

國際指南建議使用明場顯微鏡讀片至少5min［3]，本研究顯示在常規工作狀態下使用Z－N法讀片時間不足4min，使用LED法約2min，時間明顯縮短，尤其表現在判讀陰性及陽性級別較低的涂片時。但同時需要注意的是本研究中使用Z－N法的讀片平均時間略短于國際指南推薦的5min，這也可能是影響陽性患者檢出率的一個可能原因，有報道50%的患者在常規工作中由于讀片時間不足可能被丟失［4]。

中國結核病防治規劃實施指南要求初診者收集3份痰標本，隨訪患者收集2份痰標本，但本研究顯示兩類人群均有部分患者沒有能夠按照要求收集痰標本。收集3份痰標本較單獨采集1份或2份痰標本在陽性檢出率方面均有一定程度提高，但是痰標本的數量對于累計陽性檢出率提高的影響在兩種鏡檢方法有所不同。收集2份痰標本使用Z－N和LED法鏡檢累計丟失涂陽患者分別為10%和6%左右。一項綜述結果顯示，收集2份痰標本且鏡檢質量良好可以發現絕大部分（95%～98%）的涂陽患者［5]。這與本研究的結果有所差異，可能與痰標本性狀、讀片時間、人員經驗等有一定關系。

從本研究結果可以看出，LED與Z－N法相比陽性檢出率提高。其他研究結果顯示：若以培養為金標準，LED法的敏感度為84.0%，特異度為98.0%；與明場顯微鏡相比較，敏感度可提高6.0%，特異度沒有明顯降低；LED法與傳統熒光顯微鏡相比較，敏感度可提高5.0%，特異度可提高1.0%［1]。另外LED法可明顯縮短讀片時間，且染色時不需要加熱，此外操作人員對顯微鏡的對比度、信噪比、熒光均勻程度、聚焦容易度等評價均較滿意。但是在替換現有顯微鏡時需要考慮以下幾方面：（1）熒光染色抗酸菌形態不如Z－N法典型，尤其是菌量少的情況下不易與雜質區分，對于不熟悉熒光鏡檢技術的實驗人員更加明顯。（2）熒光染色涂片與Z－N法染色比較更加容易褪色，在實施痰涂片盲法復檢時需要將涂片重新脫色和染色之后進行復檢，增加復檢實驗室人員工作負荷。（3）在日樣本量低、且每日分多批次操作的實驗室，由于熒光染色時間較現有方法長（分別為15～20min、5min），可能需要較多的時間報告結果。綜合各方面，可優先考慮選擇日工作量較大的實驗室應用LED法，然后逐步擴展至其他實驗室。

志謝 感謝3省及6個縣區級實驗室工作人員在研究現場的辛勤工作。感謝香港跨國結核病參比實驗室、美國帕斯適宜衛生科技組織在數據分析和撰寫過程中給予的指導和幫助

［1] Steingart KR，Henry M，Ng V，et al.Fluorescence versus conventional sputum smear microscopy for tuberculosis：a systematic review.Lancet Infect Dis，2006，6（9）：570－581.

［2] 趙雁林.中國結核病防治規劃——痰涂片顯微鏡檢查標準化操作及質量保證手冊.北京：中國協和醫科大學出版社，2009：7.

［3] International Union Against Tuberculosis and Lung Disease（IUATLD）technical guide.sputum examination for tuberculosis by direct microscopy in low－income countries.5th ed.Paris：IUATLD.2000.

［4] Cambanis A，Ramsay A，Wirkom V，et al.Investing time in microscopy：an opportunity to optimize smear－based case detection of tuberculosis.Int J Tuberc Lung Dis，2007，11（1）：40－45.

［5] Mase SR，Ramsay A，Ng V，et al.Yield of serial sputum specimen examinations in the diagnosis of pulmonary tuberculosis：a systematic review.Int J Tuberc Lung Dis，2007，11（5）：485－495.