結核病若干問題研究進展

成詩明 莊玉輝

結核病是由結核分枝桿菌引起的一種嚴重危害人類健康的慢性傳染病。據世界衛生組織（World Health Organization，WHO）2010年全球結核病控制報告顯示［1]，2009年全球新發結核病患者940萬，共有結核病患者1400萬，死于結核病者130萬。結核病給人類的健康帶來了如此巨大的負擔，人類一直致力于結核病診斷、治療、預防等方面的研究。筆者將從以下5個方面來介紹結核病研究的一些進展。

結核分枝桿菌基因組和后基因組學的研究

隨著人類基因組計劃的成功完成，人類在破譯生命密碼的征程上邁出了堅實的一步。在此背景下，人類對模式生物如酵母、線蟲、果蠅、小鼠等的基因測序也相繼完成。1998年英國Sanger中心和法國Pasteur研究所的科學家合作完成了結核分枝桿菌H37Rv株的基因組測序工作，結核分枝桿菌H37Rv全基因組大小為4 411 529bp，G＋C含量為65.6%，編碼3988種蛋白質［2]。這標志著結核分枝桿菌的研究已經進入了基因組時代。

隨著人類進入21世紀，人類基因組的研究正在逐漸跨入后基因組時代。后基因組學又稱為功能基因組學［3]，是在基因組學前期研究成果，主要是結構基因組學研究所獲得的信息和產物的基礎上，全面、系統的分析基因的功能，力圖在基因組水平上對其基因的活動規律進行闡述。目前研究進展比較快的領域包括比較基因組學和蛋白質組學。比較基因組學是一種鑒定生物體間基因組差異，研究遺傳變異，闡明生物體間生理、生化、毒力差異的有效方法。比較基因組學的研究結果表明結核分枝桿菌復合群各菌種在脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）水平上同源性大于99.95%［4]。熊志紅等［5]用差異分析技術分析了結核分枝桿菌強毒株H37Rv和弱毒株H37Ra在體外培養條件下基因表達的差異，通過20種引物組合進行mRNA差異顯示，克隆到了兩菌株間的20余個差異表達基因，經序列分析及雜交鑒定發現其中2個基因僅在H37Rv中表達，而在H37Ra中沒有表達。比較基因組分析的結果顯示了不同結核分枝桿菌遺傳的多樣性，這可能與不同疫苗的效果不同有關［6]。

蛋白質組學可以全面分析細胞在穩定條件下產生的蛋白質的概況。應用蛋白質組可以檢測到基因組中未能檢測到的基因，是對基因組分析方面的補充。蛋白質組學研究主要技術有［7]：規?；鞍踪|微量鑒定、二維或雙向凝膠電泳分離蛋白質譜；“差異顯示”蛋白質組學；應用質譜技術或酵母雙雜交方法研究蛋白質與蛋白質的相互作用等。目前應用雙向凝膠電泳－質譜分析技術，從細菌體外培養物中共檢測到2600種蛋白斑點，如果這些蛋白斑點都是不同的蛋白質，則相當于基因組學中預測蛋白質總數的65%，進一步進行其功能學的研究將有極大的應用價值［8]。

宿主結核病易感基因的研究

結核病的發病是多因素作用的結果。在暴露于結核分枝桿菌的人群中，只有10%的人會發病［9]。這說明結核病的發病不僅與環境暴露有關，宿主自身的遺傳因素對結核病的發病也起著重要作用。目前相關的研究主要集中在以下幾種基因：自然抗性相關巨噬細胞蛋白1（natural resistanceassociated macrophage protein 1，NRAMP1）基因、維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）基因，人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）－DR基因、甘露糖結合凝集素（mannose binding lectin，MBL）基因等。

邵凌云等［10]通過病例對照研究明確了結核感染與NRAMP1基因多態性的關系。NRAMP1的不同基因多態性的協同作用導致了對結核病的易感性。

劉瑋等［11]采用病例對照研究設計，用聚合酶鏈反應－限制性片段長度多態性分析檢測VDR基因中T／C多態性位點，在多因素分析中調整卡介苗接種史和吸煙狀況后，VDR－ff基因型與肺結核發病仍有顯著性關聯（調整OR＝3.036，95%CI：1.117～8.253）。VDR－ff 基因型可能是中國漢族人群肺結核病的易感基因型。

劉志輝等［12]研究發現HLA－DR16等位基因與南方漢族部分人群的肺結核的發病明顯關聯，或與真正起作用的易感基因連鎖，中國南方漢族部分人群DR1、DR13.3等位基因的表達對結核分枝桿菌感染者的發病可能具有拮抗作用。

劉瑋等［13]采用病例對照的方法對MBL基因多態性與中國漢族人群肺結核發病的關聯進行了分析，結果顯示MBL基因XB組單倍體型與中國漢族人群肺結核發生的易感性顯著相關（調整OR＝1.60，95%CI：1.07～2.41）。

總而言之，目前的研究結果顯示人類肺結核易感性與基因多態性存在關聯，何種基因與結核病的易感性關系更為密切有待進一步的研究。相關研究的開展定能揭示結核病的遺傳學基礎，為結核病的基因治療提供思路，最終會對結核病的控制和預防發揮重要的作用。

結核病疫苗的研究

自1921年以來，由牛結核分枝桿菌經過13年230次傳代制成的減毒株－卡介苗（Bacille Calmette－Guérin，BCG）是目前世界上惟一批準用于結核病預防的疫苗。BCG對于兒童重癥結核病如粟粒型結核、結核性腦膜炎具有良好的預防保護效果［14]，但是其保護效力隨年齡增長而下降，一般為10～20年。對于青少年和成年人，其保護作用差異較大。有研究顯示BCG對成人肺結核的免疫保護作用為0%～80%［15]。鑒于BCG疫苗和單一的免疫方案的缺陷，對新型結核病疫苗和免疫接種方案的研究迫在眉睫。新型結核病疫苗不僅要對各年齡組未感染結核菌的人群提供良好的預防作用，同時要對已感染的人群提供消除體內殘留的結核分枝桿菌，防止結核病復燃的保護作用。

目前正在研發的新型疫苗包括取代BCG的初免疫苗、增強BCG效果的加強疫苗、治療性結核病疫苗。（1）取代BCG的初免疫苗：以基因重組的活疫苗為代表?；蛑亟M的活疫苗通過將特定的基因導入BCG株內，使其表達結核分枝桿菌特異性抗原。以rBCG30為代表，該疫苗是已經進入Ⅰ期臨床試驗的第一個結核病新型疫苗，通過基因重組技術，使BCG株大量表達結核菌的重要保護性抗原Ag85B。（2）增強BCG效果的加強疫苗：以腺病毒或痘苗病毒為載體的疫苗屬于該類疫苗，通過表達免疫優勢區抗原，激活免疫應答；另一類加強疫苗是基因重組蛋白亞單位疫苗，是由2～3個結核分枝桿菌或BCG抗原優勢區的抗原構成，引起的保護性免疫應答集中。但在體內滯留時間短，需采用佐劑［16]。結核分枝桿菌的免疫性保護抗原主要是分泌性蛋白，包括早期分泌 抗原靶－6（ESAT－6）、抗原 85 復 合 體（Ag85）、CFP10、MPT63、MPT64、熱 休 克 蛋 白 HSP65、HSP70等。ESAT－6、Ag85是一些早期分泌抗原蛋白。近期一項研究顯示以ESAT－6、Ag85和潛伏相關蛋白R2660C構建的H56疫苗，無論是在暴露前還是暴露后的預防中都表現出了良好的免疫效果［17]。R2660C在感染的早期和晚期均表達。在3種暴露前預防的小鼠模型中，H56對晚期感染的抑制效果要優于以ESAT－6、Ag85構建的H1疫苗及BCG疫苗。在結核菌潛伏感染的2種小鼠模型中，暴露后的H56接種能夠顯著降低疾病復發，并能顯著降低細菌負擔。（3）治療性結核病疫苗：將滅活疫苗作為輔助治療以縮短傳統的化學治療療程，目前該類疫苗包括母牛分枝桿菌疫苗、草分枝桿菌菌苗和結核分枝桿菌多糖核酸等。

2006—2015年全球控制結核病計劃中疫苗研發的主要目標是2010年有2個疫苗進入臨床試驗，2015年有一個安全有效的新型疫苗上市。

截止到2010年，已經有14個疫苗進入臨床試驗（表1），有6個結核病候選疫苗在臨床前試驗階段，還有33個新一代候選疫苗在研發早期。

結核病疫苗的研發面臨著許多挑戰［16]，如結核病疫苗的研發過程需要大量的資金投入，充實候選疫苗的產品線，同時建立大規模臨床試驗和生產能力，需要增強國家和社區對新型結核病疫苗需求的意識和支持等。

抗結核藥物的研究

目前臨床上使用的一線抗結核藥物主要有異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、鏈霉素等，這些藥物多數是在40多年前問世的，最晚的利福平也是在1965年問世的。結核病的治療主要依賴化療，但近40多年沒有突破性新藥問世，結核病化療時間長，化療方案復雜，同時結核分枝桿菌與艾滋病病毒雙重感染，耐藥結核病的產生使當前結核病防治陷入困境，亟需發展新的治療藥物。

新型抗結核藥物工作組（The Working Group on New TB Drugs）制定的結核病藥物的研發目標為：（1）縮短治療療程至2個月或更少；（2）有效地治療耐多藥結核??；（3）為結核菌潛伏感染者提供治療服務。

目前處于臨床試驗階段的新型抗結核藥物包括［18]：一種是已經作為一線或二線結核病的治療藥物，包括利福霉素類、氟喹諾酮類和嗯唑烷酮類，另一種是具有全新抗結核作用機制的藥物，包括硝基咪唑類、二芳基喹啉類、乙二胺四乙酸類和吡咯類。

目前處在臨床試驗階段藥物的研發進程見表2。

加替沙星和莫西沙星均屬于喹諾酮類藥物，目前正處于臨床Ⅲ期的評價階段。用于替換一線抗結核藥物乙胺丁醇（加替沙星和莫西沙星）或異煙肼（莫西沙星），療程從6～9個月可縮短為4個月。如果預期成功，提示這種方案將為縮短治療療程邁出重要一步［18]。OPC－67683和 PA－824均屬于硝基咪唑類藥物。PA－824目前正處于臨床Ⅱ期的研究

階段。PA－824在體外抑制活性試驗中，對包括耐藥菌株在內的多種結核分枝桿菌都表現出了較高的活性，它對目前臨床使用的其他抗結核病藥物沒有表現出交叉耐藥性，并對靜止期的結核分枝桿菌表現出了體外抑制活性，是一個很有潛力的結核病治療候選化合物［19]。TMC－207屬于二芳基喹啉類藥物，通過抑制ATP合成酶來發揮作用。SQ－109屬于乙二胺四乙酸類藥物，該化合物通過抑制細胞壁的合成來發揮作用。LL3858屬于吡咯類藥物，目前該藥處于臨床Ⅰ期評價階段。

表1 臨床試驗階段的疫苗

表2 臨床試驗階段的藥物2006—2015年的研發進程［25]

目前抗結核藥物的研發過程同樣也面臨著重要的挑戰：新藥的研發成本投入非常高；臨床試驗耗時長；缺乏支持臨床Ⅱ和Ⅲ期結核病藥物試驗的合格生物標記，也將使研發項目耗時較長、費用昂貴［18]。

結核病新型實驗室診斷方法的研究

結核病的早期、特異性的診斷是控制結核病死亡率的重要前提之一。結核病的實驗診斷的常規方法主要是痰涂片和痰培養。痰涂片鏡檢操作方便、廉價，但是陽性率較低，僅為30%～50%，其檢出靈敏度為104～105／L，屬于低靈敏度的方法［8]。熒光顯微鏡可以提高鏡檢的靈敏度，但是價格高，不適合基層使用。發光二極管（light－emitting diode，LED）顯微鏡價格優于現在的熒光顯微鏡，壽命長。Meta分析顯示：LED顯微鏡的靈敏度比傳統鏡檢方法高約10%［20]。同時該方法費用低，可廣泛推廣使用。

痰培養是診斷結核病的金標準，目前使用的培養基主要是固體羅氏培養基，需要4～6周的培養才能檢測到細菌的生長，對患者的早期診斷非常不利。目前采用液體培養的方法陽性率高于固體培養約10%～20%，同時較固體培養縮短了2～3周。我國熊禮寬等［21]曾報道，分枝桿菌變色液體培養基陽性率高，污染率低，檢出時間快。WHO推薦采用液體培養的方法用于艾滋病病毒感染者和病人合并肺結核的診斷。但是我國尚未全面推廣使用，只是在部分地區開展試點工作。

隨著分子生物學技術的發展，分子生物學的檢測技術應用越來越廣泛。目前分子生物學技術的檢測方法包括DNA探針技術、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術、DNA指紋圖譜、DNA序列測定、DNA芯片技術等。其中PCR技術靈敏度在4%～80%之間波動，特異度為80%～100%［22]。該方法操作不嚴格易出現假陽性與假陰性。WHO目前推薦一種Cepheid Xpert的實驗室診斷方法，該種方法是一種全自動核酸擴增試驗，采用封閉的系統，2h即可獲得結果，采用該檢測方法可使耐藥結核病患者的診斷陽性率提高3倍，在結核病和艾滋病高流行地區的確診的TB／HIV患者數翻倍［23]。對5個檢測點（秘魯、阿塞拜疆、南非2個，印度）的1462例結核病的疑似患者進行檢測［24]，敏感度達到了97.6%（95%CI：96.2%～98.5%），特異度達到了98.0%（95%CI：96.6%～98.9%）［23]。但是由于該方法比較昂貴，限制了其在許多國家的推廣使用。

據估計全球結核病患者中1／2由潛伏感染者發展而來，結核菌感染者的早期診斷同樣是控制結核病的一項重要措施。目前各國致力于從結核分枝桿菌分離出的特異性抗原作為診斷試劑來識別結核分枝桿菌的早期感染。近年來，γ－干擾素（γ－IFN）釋放試驗（interferon－γrelease assays，IGRA）作為一種新型診斷結核感染的免疫學方法得到了越來越廣泛的應用。該方法的設計原理是利用結核分枝桿菌特異性抗原會刺激致敏的淋巴細胞釋放γ－IFN，利用酶聯免疫吸附（ELISA）／酶聯免疫斑點（ELISPOT）進行的γ－IFN的檢測。ELISA檢測抗原刺激后γ－IFN的含量，ELISPOT檢測抗原刺激后產生γ－IFN的外周血單個核細胞數，根據斑點的數量來確定細胞分泌細胞因子的情況。從單細胞水平評價細胞免疫應答功能，從而判斷結核分枝桿菌感染的情況。目前全血ELISA商品化的試劑盒有澳大利亞Cellestis公司的Quanti FERON－TB Gold（QFT－G）和 QuantiFERON－TB Gold In Tube（QFT－IT）。ELISPOT商品化的試劑盒是英國牛津公司的T－SPOT TB。

聯合國的千年發展目標為到2015年結核病的發病率停止上升并逐漸下降；遏制結核病伙伴制定的相應的目標為到2015年，結核病患病率和死亡率在1990年基線上降低50%；到2050年，消除作為公共衛生問題的結核病。世界各國目前正朝著這個方向積極努力，希望隨著各國政府承諾的增強，經費投入的增加，在結核病的診斷、治療、預防等各個方面在未來都能取得突破，最終真正的實現一個無結核病世界的美好愿景。

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