小飛蓬活性成分對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的作用

吳珊珊,郭,張麗紅,邱心如,王醫(yī)術(shù)*,嚴(yán)銘銘

(1.吉林大學(xué)病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林長(zhǎng)春130021;2.吉林大學(xué)藥學(xué)院2009級(jí),3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué))

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在我國(guó)占全體惡性腫瘤的7%-10%[1],嚴(yán)重威脅婦女身心健康甚至危及生命。而據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,中藥小飛蓬除了具有較強(qiáng)的抗氧化,抗衰老,抗突變,調(diào)血脂的藥理作用外,還具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用。因此,本實(shí)驗(yàn)研究小飛蓬活性物質(zhì)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞,購(gòu)于上海中科院細(xì)胞研究所。

1.1.2 主要試劑 CCK-8購(gòu)至Dojindo公司;5-氟尿嘧啶購(gòu)至天津金耀氨基酸公司;免疫組織化學(xué)染色試劑盒購(gòu)至福州邁新生物技術(shù)公司;MMP-9購(gòu)至BD公司,Caspase-3購(gòu)至Gene公司;小飛蓬活性物質(zhì)由長(zhǎng)春中醫(yī)學(xué)院提取提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FCS的H-DMEM培養(yǎng)基中。

1.2.2 CCK-8試劑盒測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞,以2×104?mL-1加入96孔板內(nèi),0.1 mL-1孔。小飛蓬作用組按照濃度 1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04 mg.L-1分成 6組,每組設(shè) 2個(gè)平行孔;5-FU為陽(yáng)性對(duì)照,按照0.025 、0.0125 、0.00625 、0.003125 、0.001563 、0.000782 mg?mL-1分成6組,每組亦設(shè)2個(gè)平行孔;設(shè)2個(gè)不加藥的為陰性對(duì)照。常規(guī)培養(yǎng)72 h后,小心吸棄上清,每孔加入含 10 μ L CCK-8 的 RPMI-1640 0.1 mL。另設(shè)一孔僅加入含 10 μ L CCK-8的 RPMI-1640 0.1 mL為空白對(duì)照孔,37℃、5%CO2培養(yǎng)3 h后,在Biored 550酶標(biāo)儀上以空白對(duì)照孔調(diào)零后,在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光光度值(A值),計(jì)算小飛蓬及5-FU對(duì)MCF7的生長(zhǎng)抑制率,求出IC50。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照孔A值—加藥孔A值)/對(duì)照孔A值×100%。

1.2.3 繪制生長(zhǎng)曲線 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為9×104?mL-1,接種。根據(jù) IC50值,小飛蓬組設(shè)3個(gè)濃度組,分別為低劑量組(1/2 IC50值)、中劑量組(IC50值)、高劑量組(2×IC50值),陽(yáng)性對(duì)照組5-FU濃度為IC50值,陰性對(duì)照組不加藥(0mg?mL-1)。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,37℃、5%CO2孵育。共計(jì)數(shù)7天,繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 常規(guī)細(xì)胞爬片(細(xì)胞密度及藥物濃度等同于生長(zhǎng)曲線)。將爬片水化后,0.3%Triton-X100 40μ L,作用 18m in 后 EDTA 修復(fù)液修復(fù),沖洗后滴加阻斷劑20 min,血清覆蓋15 min,直接加入一抗(稀釋比例為1∶200),4℃過(guò)夜。按說(shuō)明滴加二抗、三抗后DAB發(fā)色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核,常規(guī)脫水透明,中性樹(shù)脂封片。結(jié)果判定:Caspase-3、MMP-9均以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性。每張爬片選5個(gè)不同視野采集圖像。統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞的灰度值,單位為像素。

2 結(jié)果

2.1 小飛蓬對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用

CCK-8試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示,小飛蓬對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用,且抑制作用隨小飛蓬濃度的升高而增大,其 IC50值為 0.29 mg?mL-1,5-FU對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50值為0.0022 mg?mL-1,P ＜0.05。結(jié)果見(jiàn)表1、2。

2.2 小飛蓬作用MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

選擇不同藥物濃度作用的MCF-7細(xì)胞繪制生長(zhǎng)曲線,結(jié)果顯示,小飛蓬對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯劑量依賴(lài)性抑制作用,與對(duì)照組相比差異明顯(P＜0.05),與現(xiàn)有陽(yáng)性對(duì)照藥5-FU相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 小飛蓬對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)的抑制

表2 5-FU對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用

2.3 MCF-7細(xì)胞形態(tài)的變化

倒置相差顯微鏡下觀察藥物作用后細(xì)胞形態(tài)改變:對(duì)照組(0 mg?mL-1)細(xì)胞,呈三角形或多角形,粘附性好,折光性強(qiáng)。小飛蓬低劑量組(0.145 mg?mL-1)細(xì)胞呈多角型,死亡較少,粘附性好,折光性較強(qiáng),狀態(tài)較好;小飛蓬中劑量組(0.29 mg?mL-1)細(xì)胞變長(zhǎng),死亡較多,粘附性減弱,折光性減弱;小飛蓬高劑量組(0.58 mg?mL-1)細(xì)胞變長(zhǎng),死亡更多,折光性差。5-FU在濃度為0.0022 mg?mL-1時(shí),細(xì)胞呈不規(guī)則形,有部分細(xì)胞死亡,折光性減弱。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖1 小飛蓬作用MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

圖2 小飛蓬作用后24小時(shí)后MCF-7細(xì)胞的狀態(tài)(×200)

2.4 MCF-7細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá)

對(duì)照組無(wú)Caspase-3表達(dá)為陰性,小飛蓬組Caspase-3表達(dá)較強(qiáng),隨著濃度的增加表達(dá)增強(qiáng),5-FU組為弱表達(dá),小飛蓬2個(gè)組Caspase-3表達(dá)高于對(duì)照組(P ＜0.001),小飛蓬高劑量組(0.58 mg?mL-1)、中劑量組(0.29 mg?mL-1)Caspase-3表達(dá)與5-FU(P＜0.01)相近,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表3,圖3。

表3 MCF-7細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá)

2.5 MCF-7細(xì)胞中MMP-9表達(dá)情況

MMP-9免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果提示,對(duì)照組MMP-9表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性,小飛蓬組表達(dá)弱于對(duì)照組,且隨著濃度的增高,表達(dá)下降(P＜0.001)。結(jié)果見(jiàn)表4及圖4。

表4 MCF-7細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)

圖3 Caspase-3在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)(×200)

圖4 MMP-9在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)(×200)

3 討論

乳腺癌已成為我國(guó)婦女中發(fā)病率最高的惡性腫瘤,雖有手術(shù)、放療、化療、生物療法等多種方法,但中藥的抗癌作用日益受到人們的重視[2]。小飛蓬(Erigeron canadensis L.)又名祁州一枝蒿、蛇舌草、竹葉艾、魚(yú)膽草、苦蒿,是菊科飛蓬屬的一年生草本植物,廣泛分布于中國(guó)各地。有文獻(xiàn)記載小飛蓬的藥用有清熱利濕、散瘀消腫、改善腎的微循環(huán)的功效并且還具有較強(qiáng)抗腫瘤的藥理作用[3]。黃酮類(lèi)成分為小飛蓬抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、治療心腦血管疾病的主要有效部位[4]。但迄今為止,小飛蓬對(duì)MCF-7是否有抑制作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察小飛蓬對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。本研究應(yīng)用CCK-8試劑盒測(cè)得小飛蓬可以抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng),IC50值為 0.29 mg?mL-1;進(jìn)一步通過(guò)繪制MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)曲線觀察到,小飛蓬對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯劑量依賴(lài)性抑制作用。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)小飛蓬作用后MCF-7細(xì)胞形態(tài)的改變,細(xì)胞由多角型、附壁性好逐漸變長(zhǎng),死亡多,胞漿內(nèi)顆粒增多,折光性差。上述結(jié)果均表明小飛蓬可抑制MCF-7生長(zhǎng),并降低細(xì)胞粘附性和鋪展能力。Caspase為半胱氨酸天門(mén)冬氨酸蛋白酶簡(jiǎn)稱(chēng),在正常狀態(tài)下以無(wú)活性的酶原形式存在。當(dāng)在凋亡信號(hào)刺激下被激活,上游的Caspase有次序的激活下游的Caspase,形成Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),將凋亡信號(hào)傳遞到凋亡底物。1993年首次發(fā)現(xiàn)Caspase參與細(xì)胞凋亡過(guò)程以來(lái),大量研究表明,Caspase-3在細(xì)胞凋亡過(guò)程中處于中心地位,是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)因子[5,6]。Caspase-3蛋白酶是凋亡中最重要的因子,其在Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中處于核心地位,Caspase-3的剪切活化是細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵步驟及一切凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的共同通路,所以該蛋白酶也被稱(chēng)為死亡蛋白酶[7]。本研究通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè) Caspase-3在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)。研究結(jié)果表明,小飛蓬作用細(xì)胞后Caspase 3的活性明顯強(qiáng)于對(duì)照組,并呈劑量依賴(lài)。因而,我們得出結(jié)論,小飛蓬體外對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用是通過(guò)激活Caspase 3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的。在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的復(fù)雜過(guò)程中,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)起著重要的作用。而MMP-2、MMP-9能降解明膠和IV 、V、Ⅶ、X 型基底膜膠原,允許內(nèi)皮細(xì)胞降解并浸潤(rùn)血管基底膜,產(chǎn)生ECM降解產(chǎn)物,從而趨化內(nèi)皮細(xì)胞,激活并固定ECM中的生長(zhǎng)因子[8]。研究者在腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著極為重要的作用[9]。閆承慧等在體外培養(yǎng)肺腺癌細(xì)胞系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腺癌細(xì)胞產(chǎn)生MMP的能力與其轉(zhuǎn)移能力有一定相關(guān)性,轉(zhuǎn)移能力相對(duì)高的細(xì)胞系中MMP-2與MMP-9的活性均較高,而轉(zhuǎn)移能力相對(duì)較低的細(xì)胞系中則只表達(dá)MMP-2,不表達(dá)MMP-9[10]。表明MMP-9的表達(dá)與腫瘤高轉(zhuǎn)移能力更為相關(guān)。本研究體外實(shí)驗(yàn)MMP-9免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果提示,對(duì)照組MMP-9表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性,小飛蓬組表達(dá)弱于對(duì)照組,且隨著濃度的增高,表達(dá)下降。說(shuō)明小飛蓬在體外可抑制MCF-7細(xì)胞MMP-9的表達(dá),從而抑制其侵襲能力。

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