妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者外周血腫瘤細(xì)胞檢測(cè)方法的研究

蘭 晶

(安陽(yáng)市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,河南安陽(yáng)455000)

本文通過熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(FQRT-PCR),檢測(cè)β-hCG-mRNA,建立在外周血中檢出滋養(yǎng)細(xì)胞方法,推測(cè)妊娠腫瘤患者外周血中滋養(yǎng)細(xì)胞的含量,為腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移做預(yù)防。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

11例患者中,絨毛膜癌6例,臨床分期:Ⅰ期2例,Ⅱ期3例,Ⅲ期 1例;葡萄胎5例,臨床分期:Ⅰ期1例,Ⅱ a期2例,Ⅲb期1例;Ⅳ期1例,各例均于治療前采集外周血10 ml。非妊娠期婦女血液來自遼寧省血液中心。均為健康新鮮血液。

1.2 試劑與儀器

JAR細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù);新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所);IV膠原酶(美國(guó)Sigma公司);TRIZOL RNA提取液(美國(guó)Gibeo BRL公司);瓊脂糖(美國(guó)Promega公司);RPNI 1640培養(yǎng)液(北京萬域美瀾科技);電泳儀及電泳槽(美國(guó)Bio伯樂公司);CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Forma公司);紫外分光光度儀(北京凱慕公司);2720 FQ-PCR儀(美國(guó)ABI公司);低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);Ficoll(上海試劑二廠);焦碳酸二乙酯;(美國(guó)BIO伯樂公司);DNase I(上海浩然生物技術(shù)公司);M-MLV逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(美國(guó)1NB公司);PCR反應(yīng)體系(上海生物工程有限公司);100 bp PCR 1VIarker(英國(guó)INB公司);熒光探針由美國(guó)PE公司合成;引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 JAR細(xì)胞加入外周血中實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕AR細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,24 h后取上清液,用PBS洗后用膠原酶消化2-3 min,加10%FCS吹打成細(xì)胞懸液,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10/ml,至1×107/ml。取非妊娠期婦女外周血與JAR細(xì)胞混合,每管10 ml。臺(tái)盼藍(lán)染色。

1.3.2 總RNA提取 TRIZOL試劑盒提取RNA,提取的經(jīng)DNaseI處理以去除總RNA基因組DNA。紫外分光光度儀測(cè)定其量及純度。

1.3.3 引物與探針 上游引物:5-TGC CAC CCT GGC TGT GGA-3;下游引物 :5-GCG GTA GTI”GCA CAC CAC CTG-3。熒光探針序列:5-TCA CCG TCA ACA CCA CCA TCT GTG C-3。

1.3.4 熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶(FQ-RT-PCR) 逆轉(zhuǎn)錄合成CDNA第一鏈,總反應(yīng)體系補(bǔ)充無RNase水至20 ml。37℃水浴40min,95%5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶后,立即零下20℃保存待測(cè)。FQ-PCR:總反應(yīng)后補(bǔ)無RNase水至50 ml。在93、93.5、55℃分別反應(yīng) 2 min,45 s,120 s,于PE5700 DNA擴(kuò)增儀上40次循環(huán),計(jì)算機(jī)隨時(shí)分析記錄,擴(kuò)增結(jié)束時(shí)得出定量結(jié)果。

1.3.5 妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤病人外周血中β-hCG-mRNA的檢測(cè) 11例患者外周血10 ml,測(cè)定β-hCG-mRNA,使用上述引物與探針,進(jìn)行FQ-RT-PCR,同時(shí)與1.3.1中測(cè)得的13-hCG-mRNA值作比較,腫瘤細(xì)胞的含量以外標(biāo)準(zhǔn)推算。

2 結(jié)果

2.1 FQ-RT-PCR檢測(cè)JAR細(xì)胞β-hCG-mRNA表達(dá)水平

JAR與探針熒光循環(huán)數(shù)呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)JAR細(xì)胞的數(shù)量遞減相當(dāng)于 mRNA 量的 10 、102、103、104、105、106個(gè)檢測(cè)到探針熒光釋放所需的循環(huán)數(shù)遞增至16 、19 、21 、25 、26 、29 。Y=2.4X+27.3,r=-0.99,P≤0 001.

2.2 外周血加入JAR細(xì)胞后β-hCG-mRNA檢測(cè)

當(dāng)細(xì)胞數(shù) ≥10/ml時(shí),可以檢測(cè)到 β-hCG-mRNA且細(xì)胞數(shù)目與未滲入血時(shí)相近。當(dāng)細(xì)胞數(shù)＜10/ml時(shí)無法檢測(cè)到細(xì)胞數(shù)。外周血加入JAR的檢測(cè)效率較低。

2.3 妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者外周血中β-hCG-mRNA檢測(cè)

11例妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者中有6例檢測(cè)到JAR細(xì)胞。5例沒有檢測(cè)到。檢測(cè)到的患者滋養(yǎng)細(xì)胞量經(jīng)推算為104-106。檢測(cè)到的5例患者細(xì)胞量小于104,或者是陰性。見表1。

表1 妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者外周血中滋養(yǎng)細(xì)胞的個(gè)數(shù)(例)

3 討論

惡性腫瘤對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅,腫瘤死亡率高的的主要原因是部分腫瘤細(xì)胞獲得侵襲能力并造成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病是一種與妊娠密切相關(guān)的疾病,包括絨癌、葡萄胎、侵蝕性葡萄胎和胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤,其本質(zhì)是胎盤絨毛細(xì)胞變性或過度增生[2-4]。雖然目前腫瘤治療有許多先進(jìn)技術(shù)做為支撐,但是臨床反饋腫瘤的患者的總體治愈率、生存率仍然非常低,患者的生活質(zhì)量得不到提高,診斷的遲滯、腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍舊是造成患者死亡的主要原因。本研究以外周血為研究對(duì)象,外周血容易獲得取材方便,其檢測(cè)手段容易操控,對(duì)惡性腫瘤的早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)、早期處理轉(zhuǎn)移及預(yù)后具有很大的意義,為惡性腫瘤的診治提供了必要的依據(jù)。

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)在臨床上廣泛應(yīng)用于檢測(cè)突變基因的mRNA和腫瘤的表達(dá)。細(xì)胞死亡伴隨著RNA在血液中迅速降解,而非細(xì)胞碎片或是游離RNA。因此在RT-PCR過程中,腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展情況完全可以通過檢測(cè)RNA來實(shí)現(xiàn)。大量研究表明RT-PCR與免疫細(xì)胞化學(xué)相比較的的敏感性要高很多[3-6]。RT-PCR的優(yōu)勢(shì)在于能夠避免PCR產(chǎn)物的污染,操作簡(jiǎn)便可控性能高,線性范圍寬及精密度好。RNA提取效率高,精密度測(cè)試結(jié)果表明本此方法具有良好的重復(fù)性[7]。本研究線性相關(guān)性好,對(duì)于加入外周血的樣品,在一定的濃度其測(cè)量值影響不大。然而,由于樣品的污染是不可避免的,游離RNA和基因組DNA的存在使正常細(xì)胞表達(dá)具有一定的干擾性,RT-PCR的結(jié)果容易受假陽(yáng)性的影響,不過可以通過添加脫氧核糖核酸酶和增加密度梯度來消除上述影響。核酸的檢測(cè)方法敏感性較高但是特異性對(duì)結(jié)果不是很靈敏。定量RT-PCR能夠使腫瘤細(xì)胞mRNA和正常細(xì)胞表達(dá)鑒別更加準(zhǔn)確,但是由于組織特異性標(biāo)志物的不足仍是目前研究中的最大難題。本研究將絨癌細(xì)胞株(JAR細(xì)胞)摻入滋養(yǎng)細(xì)胞外周血液中,來檢測(cè)β-hCG-mRNA,以此檢測(cè)值推算血液中的細(xì)胞量,并以此推算患者外周血中腫瘤細(xì)胞的量。本研究結(jié)果顯示,盡管FQ-PCR法在JAR細(xì)胞表達(dá)的mRNA量檢測(cè)在檢測(cè)結(jié)果比較精密,但是當(dāng)JAR細(xì)胞與外周血在一起后分離,只有在每10 ml血中超過103時(shí)方能檢測(cè)到,而且隨著JAR細(xì)胞數(shù)量的增加,FQ-PCR所要求的循環(huán)數(shù)相應(yīng)的呈減少的態(tài)勢(shì),呈現(xiàn)比較理想的負(fù)性線性關(guān)系。

選用適當(dāng)?shù)哪[瘤標(biāo)志物是對(duì)腫瘤外周血液中腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)成功與否的關(guān)鍵因素,本研究選用絨癌細(xì)胞株(JAR細(xì)胞)為標(biāo)志物,在臨床上具有一定的可行性,與以往的文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]。認(rèn)為此種檢測(cè)方法在臨床上有一定的應(yīng)用價(jià)值,可以考慮進(jìn)行進(jìn)一步的研究,以利于腫瘤工作的預(yù)防性檢測(cè)工作。

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