血清肌酐測定方法學的局限性及臨床應用的相對性

姚艷霞

(中國核工業北京四零一醫院檢驗科,北京102413)

血清肌酐濃度測定對臨床診斷和治療有重要意義,其測定結果必須準確可靠。目前臨床使用的幾種肌酐檢測方法,特異性和抗干擾性各具特點,肌酐測定的參考范圍也受多種因素的影響,因此就肌酐檢測的方法學和參考值做以下綜述。

血清肌酐濃度測定是評價腎小球濾過率(GFR)的有效指標,在急性腎功能衰竭和慢性進行性腎功衰竭時,血清肌酐測定都有助于臨床判斷病情,特別是兒科和腎移植病人的診斷、病程判斷、療效觀察等,血肌酐連續監測的結果更具臨床參考價值。但一個檢驗指標能否有效的在臨床應用的前提是測定結果必須準確可靠,況且血肌酐測定值又是計算GFR的數學依據,只有其測定結果準確和重復性好,才能保證GFR的準確計算[1]。臨床實驗室已采用過的主要的肌酐測定方法已見報告的達10余種。目前臨床常用的肌酐測定方法有堿性苦味酸法(又稱Jaffes法)和酶學方法。這二類方法都存在非特異性等局限性。

1 堿性苦味酸法的非特異性對測定結果準確性的影響[2]

依據肌酐Jaffe's法的反應原理,凡含有甲基或亞甲基功能團的化合物均可與苦味酸發生類似反應,生成α-甲基酮或α-亞甲基酮類化合物而使結果偽陽性升高,如某些氨基酸、蛋白質、丙酮酸、抗壞血栓、丙酮、乙酸、乙酰乙酸、高濃度葡萄糖、果糖等。

Jaffé終點法為減少干擾曾采用過三氯醋酸沉淀蛋白,離心取上清液測定;也曾采用Fuller's土(漂白土)去蛋白等干擾物的方法。Jaffé兩點動力學法,取測定時間(“窗時間”)t1為30秒,t2為120秒,從而避開來自“快干擾物”和“慢干擾物”的干擾。但是,有一些干擾物的反應速度與肌酐相近似,如丙酮酸、α-酮戊二酸,特別是糖尿病患者、腎病酮癥酸中毒血清中酮體干擾明顯,即使采用了Jaffé兩點動力學方法也難于排除這部分干擾。除了偽陽性干擾外,還存在偽陰性干擾物,常見的是膽紅素。膽紅素會使肌酐測定結果偏低,當膽紅素濃度升至35mg/dl(600umol/L)時干擾明顯[3]。對此,有的肌酐試劑盒通過加入膽紅素氧化酶或亞鐵氰化鉀予處理樣品,而降低其干擾。

2 酶學方法的特異性是相對特異性[4,5]

在臨床化學方法學發展中酶學方法的運用,使臨床化學測定技術有了一個質的飛躍。其核心是酶作用特異性高,使測定的準確性、靈敏度、重復性、線性測量范圍等都有了相應的大幅度提高。酶法提高了檢測的特異性,但并非絕對特異性。雖同屬酶法也各自存在不同類型和大小不一的干擾。目前臨床常規化驗采用較多的酶法試劑盒是肌酐酰胺水解酶偶聯肌酸酶/肌氨酸氧化酶/過氧化物酶法,這種方法存在內源性肌酐的干擾,并且增加了樣品中還原性物質的干擾。藥物維生素C,還原型谷胱苷肽,膽紅素,氫醌磺酸鈣,他巴唑,α-甲基多巴苯藥物劑量大時可產生偽陰性干擾,可通過加入抗壞血酸氧化酶、谷胱甘肽氧化酶及膽紅素氧化酶等雙試劑法去除維生素C、還原型谷胱甘肽和膽紅素的干擾。

另一酶法是采用肌酐亞胺水解酶偶聯谷氨酸脫氫酶反應紫外(A340nm)測定法[6,7],此法采用肌酐亞胺水解酶(creatinine deiminase,縮寫為CDI)水解肌酐產生甲內酰脲和氨,再偶聯谷氨酸脫氫酶(GLDH)在還原型輔酶Ⅱ(NADPH)存在下催化α-酮戊二酸與氨反應生成谷氨酸,同時NADPH氧化轉化為NADP+,可監測A340 nm下降速度,以計算血清肌酐含量。從此反應原理可見樣品中內源性氨是主要干擾物。葡萄糖,氨基酸也造成偽陽性干擾;總膽紅素濃度達到12mg/dl(≥207 mmol/L)時產生偽陰性干擾。采用CDI作為工具酶的商品試劑盒存在的另一個重要問題是原料CDI缺乏特異性,可非特異地水解胞嘧啶相關化合物,造成測定結果偽陽性偏差。在臨床治療用的一些藥物如某些抗癌藥、治療白血病、乙肝藥物中含有胞嘧啶類化合物,使用這類藥物治療的患者檢測血肌酐濃度時,就會造成化驗結果偽陽性升高,因此消除和降低這類藥物干擾應引起重視,以避免誤診。

3 方法靈敏度、線性范圍對臨床應用的影響

對一個方法學性能的評價除特異性,準確性之外,分析靈敏度、分析變異和線性測量范圍也必須予以重視與酶法相比Jaffe終點和兩點法靈敏度和線性測量范圍都比較低。酶法試劑盒商家提供的資料線性測量范圍低者7 080μ mol/l,高者達26 550μ mol/l,現將搜集的資料列表2。

表2 不同方法和試劑盒性能比較

一項研究證明,因Jaffe's兩點動力學法線性測量范圍低,在高值(肌酐濃度＞4 mmol/dl)樣品 Jaffe's兩點動力學法測不上去而結果比酶法偏低;但在低值(肌酐濃度＜4 mmol/dl)樣品Jaffe's兩點動力學法結果比酶法偏高,這是因為非特異性干擾所致。

4 生物學變異和分析變異對臨床應用的影響

肌酐的生物學變異和分析變異對臨床應用的影響應引起高度重視。首先是生物學變異,其中包括年齡,性別,飲食等等,大運動量的男性約升高20%,不分性別的季節律(夏季)約升高6%,晝夜(夜間)約升高 5%;55-60歲的老年人約升高5%。4-10歲兒童約降低5%;妊娠約降低6%,分析變異在手工,半自動和全自動之間也存在較大差異,當前我國執行的CLIA88允許誤差范圍為靶值±26.5μ mol/L或靶值±15%(取大值)。但是,在2002年北京地區 30家醫院檢驗科生化室參加國際測量評價計劃-7(IMEP-7)的回報結果與液相色譜-同位素稀釋質譜(LC-IDMS)法確定的靶值74.57 μ mol/L相比,偏倚的變化范圍為2.18%-38.66%,最小值為66 μ mol/L,最大值為 105.3 μ mol/L。在如此大的生物學變異和分析變異的前提下,一要做好室內質控,二要在臨床應用肌酐結果時,不能只憑肌酐的一次化驗結果而下定論。

5 方法間的系統誤差與參考值

Jaffe終點法與Jaffe兩點法之間,存在一定差異,理論上后者比前者偏低;各種酶法與Jaffe兩點法之間,雖然相關良好,但存在明顯的系統誤差,偏倚(a)分布在16 μ mol/l-35 μ mol/L之間[8,9]。因為方法間、試劑盒原理和性能質量間存在差異,所以血肌酐參考值的報告也不盡相同,現將搜集到的部分資料列在表3。在一項最新的研究資料中報告了血清肌酐酶法測定獲得的不同年齡段的參考范圍,可見成人高于兒童,男女間也有差異,如表4[10]。

表3 不同方法和不同資料來源的血肌酐參考范圍

表4 血清肌酐濃度參考范圍

從表3表4不難看出,到底哪個參考范圍更科學,準確,很難下結論,因為影響因素太多了。由此可見,在如此大的生物學變異和分析變異的前提下,參考值給出的不同方法間、性別間、年齡間的差異,其臨床應用需慎重。在臨床實踐中,各實驗室建立自己的參考范圍更有必要;在臨床應用中,應把肌酐測定結果與其他腎功指標及臨床表現綜合分析,以提高實驗診斷臨床應用的可靠性[11]。

[1]Lothar Thomas,肌酐[M]臨床實驗診斷學,上海科學技術出版社,主編:托馬斯,主譯:呂 元,朱漢民,沈 霞等,2004:342.

[2]王卉研.膽紅素對酶法和堿性苦味酸法測定肌酐的影響[J].醫療裝備,2009,22(12):43.

[3]張傳洽,Jaffe′速率法、電極法和酶法測定肌酐結果的比較[J].國際檢驗醫學雜志,2006,27(3):283.

[4]張 超,血清肌酐肌氨酸氧化酶法與苦味酸動力學法檢測結果的比較[J].中華檢驗醫學雜志,2006,29(6):651.

[5]陳筱菲,倪甘甜.酶法與堿性苦味酸法測定肌酐清除值的差異情況研究[J].檢驗醫學,2010,25(4):24.

[6]徐國賓,朱立華,夏鐵安.用肌酐亞氨水解酶偶聯谷氨酸脫氫酶的肌酐酶法測定[J].臨床檢驗雜志,2001,19(3):149.

[7]梁國慶,張 萍,張 利.酶法與Jaffe′速率法檢測肌酐結果的探討[J].國際檢驗醫學雜志,2008,29(9):864.

[8]張東玲.肌酸測定方法學進展[J].國際檢驗醫學雜志,2006,27(6):521.

[9]徐國賓.應關注 eGFR的正確應用和人血清肌酐測定的標準化[J].2008年衛生部臨床檢驗中心臨床化學室間質量評價總結大會資料匯編,2008:60.

[10]Mauro Panteghini,Engymatic assays for creatinine:time for action[J].Clin.chem.Lab.Med,2008,46(4):567.

[11]張建平,王治國.肌酐檢測的準確性問題研究[J].國際檢驗醫學雜志,2008,29(6):501.