八肋游仆蟲中心蛋白N端半分子Loop區首個氨基酸的作用

趙 冰 段 煉 劉 文 趙亞琴 楊斌盛

(山西大學分子科學研究所，太原 030006)

八肋游仆蟲中心蛋白N端半分子Loop區首個氨基酸的作用

趙 冰 段 煉 劉 文 趙亞琴 楊斌盛＊

(山西大學分子科學研究所，太原 030006)

本文通過分子生物學方法將八肋游仆蟲中心蛋白N端半分子loop區的首個氨基酸，天冬氨酸Asp37和Asp73，分別突變為帶相反電荷的賴氨酸。使用鋱敏化熒光、TNS疏水探針研究了八肋游仆蟲中心蛋白N端半分子loop區的首個氨基酸的作用。結果表明：當中心蛋白loopⅠ區37位的天冬氨酸突變為賴氨酸后，loopⅠ喪失了金屬離子結合能力，進而影響了中心蛋白依賴于金屬離子的構象變化；而loopⅡ區73位的天冬氨酸突變為賴氨酸后仍保持金屬離子結合能力，依賴于金屬離子的構象變化減小。中心蛋白發揮大部分生物功能都依賴于金屬離子，這就表明loopⅠ區37位的天冬氨酸在中心蛋白發揮生物功能時起著重要作用，是不可缺少的。在10 mmol·L-1Hepes、pH 7.4、20 mmol·L-1KCl條件下，八肋游仆蟲中心蛋白N端半分子loopⅡ與金屬離子 Tb3+和 Ca2+的結合常數分別為：KⅡ(Tb3+)=(8.31±0.18)×104L·mol-1和 KⅡ(Ca2+)=(0.94±0.12)×102L·mol-1，中心蛋白 N 端半分子的兩個金屬結合部位結合能力順序為：Ⅰ＞Ⅱ。

中心蛋白；N端半分子；Tb3+；Ca2+；TNS

中心蛋白是分子量約為20 kDa的酸性蛋白，屬于高度保守的EF-Hand鈣結合蛋白超家族[1-2]。自從綠藻中心蛋白發現以來，這些蛋白在微管組織中心(MTOC)中時間和空間上的分布，以及這種蛋白在細胞循環調控中的重要作用就成了細胞生物學研究的內容之一[2-6]。最初，中心蛋白被認為是纖維的主要成分，參與核與鞭毛單細胞鞭毛器的連接，隨后發現，中心蛋白是中心粒、中心體以及有絲分裂紡錘體極體中廣泛存在的組成成分[3,7-8]。

八肋游仆蟲中心蛋白(EoCen)與人中心蛋白HsCenl、HsCen2、HsCen3以及鈣調蛋白的同源性分別為60%、62%、66%和50%[9]。氨基酸序列分析表明EoCen由2個相對獨立的區域(N端和C端)組成，每個區域包含2個EF-Hand結構和2個鈣離子結合位點。由于每個EF-Hand的氨基酸序列都不同，這就決定了4個鈣離子結合位點的性質也不同[10]。例如人中心蛋白HsCen2的loopⅣ區有一個高親和位點[11-12]，而HsCen3則表現出不同的結合行為：它有3個Ca2+結合位點，其中1個位于N端區域，而且是1個Ca2+/Mg2+的混合結合位點[12-13]。本實驗室過去的研究工作發現，八肋游仆蟲中心蛋白的4個Ca2+結合位點可分為兩類，分別是C端熒光弱敏化的高親和位點和N端熒光強敏化的低親和位點，4個結合部位結合能力為Ⅳ＞Ⅲ＞Ⅰ，Ⅱ[14]。

圖1為鈣調蛋白N端半分子的2個EF-Hand結構結合金屬離子前后的構象變化[15]。中心蛋白結合金屬離子的結構模式可能與鈣調蛋白類似。

圖1 鈣調蛋白N端半分子結合金屬離子前后的構象變化[15]Fig.1 Conformational change of N-terminal EF-Hand domain of CaM induced by Ca2+[15]

中心蛋白可能是一個鈣離子傳感器，在Ca2+飽和狀態下，中心蛋白與特定的靶蛋白相互作用來調控細胞活性。一般來說，Ca2+的結合使得EF-Hand結構的α螺旋發生改變，轉為以“開放”的構象存在，這樣就導致了疏水腔的暴露，進而結合靶肽[13,16]。蛋白質發揮功能時通常伴隨著構象的變化，2-對甲苯胺基-6-萘磺酸(TNS)已經被廣泛用于金屬離子誘導的中心蛋白構象變化的探針[17]。本實驗室過去的研究發現：中心蛋白結合金屬離子后，C端和N端發生的構象變化是不同的，N端能暴露出比C端更多的疏水表面[18]。

中心蛋白loop區最規范的序列中都包含3個D(天冬氨酸)，目前所發現的EF-hand結構中，第一位的D都是非常保守的，很少有第一位不是D的[16]。由于中心蛋白N端是高變區，有人預測它與不同中心蛋白的功能多樣性有關[3,11,19]。本文將中心蛋白N端半分子loop區的首個氨基酸天冬氨酸突變為賴氨酸，研究N端Ⅰ、Ⅱ結合部位結合能力的差異以及天冬氨酸在N端半分子構象變化中的作用，從而探索N端半分子首個氨基酸在中心蛋白發揮生物功能中的作用。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(Hepes)；2-對甲苯胺基-6-萘磺酸 (TNS)(Sigma公司)；稀土氧化物Tb4O7，純度不低于99.99%(湖南稀土金屬材料研究所產品)；其他均為分析純試劑。

主要酶及生化試劑：限制性內切核酸酶BamHⅠ、SalⅠ、T4DNA連接酶，為Promega公司產品；Taq DNA聚合酶購于大連TaKaRa公司；質粒小量提取試劑盒及DNA回收試劑盒購于上海華舜生物工程有限公司；LB培養基所用的試劑Tryptone、Yeast Extract、Sodium Chloride 購 于 上 海 Sangon 公司；核酸分子量標準為MBI公司產品。

Hitachi F-2500和Hitachi-850熒光光譜儀、HP8453UV-Vis吸收光譜儀、Beckman酸度計、PM-10超濾膜、Eppendorf移液槍、Amicon Model 8010超濾器。

1.2 儲備液的配制

稀土溶液：將稀土氧化物(Tb4O7)用適量的濃鹽酸溶解，用雙蒸水配成pH=5～6的溶液備用，以二甲酚橙為指示劑，在pH=5.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液中用標準EDTA溶液滴定，測定其標準濃度。

TNS溶液：稱取一定量的TNS，加入少量NaOH溶液溶解，三次蒸餾水定容到50 mL，4℃放置備用，使用時稀釋到所需濃度。

1.3 蛋白的表達和純化

在八肋游仆蟲中心蛋白N端半分子N-EoCen質粒的基礎上用突變試劑盒TaKaRa MutanBEST Kit D401通過定點突變技術得到了重組表達質粒pGEX-6p-N-D73K。利用PCR技術，在全分子突變體D37K的基礎上得到了N端突變體N-D37K。DNA序列測定表明所得到的突變體只含有目的位點的突變基因，而沒有其他任何位點的隨機突變。將重組質粒轉入大腸桿菌BL21感受態細胞中，在誘導劑IPTG誘導下實現蛋白可溶性表達。融合蛋白經PPase酶切和GST親和層析后得到目的蛋白。同時將野生型蛋白(EoCen)和課題組之前構建完成的片段分子蛋白(N-EoCen)誘導表達純化得到目的蛋白。經SDS-PAGE分析顯示所有蛋白均不含雜蛋白條帶，達到實驗所需純度。

1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠包含 390 mmol·L-1Tris(pH 8.8),10%過硫酸銨，15%acrylamide/bis(29∶1)，0.05%TEMED。Tris-Glycine電泳緩沖液包含25 mmol·L-1Tris(pH 8.3)，250 mmol·L-1甘氨酸。電泳在室溫下進行，天然膠用冰袋保護。樣品在濃縮膠部分時，電泳儀電源電壓設置為80 V，樣品進入到分離膠后將電壓調為120 V。電泳時間約為2 h。電泳完成后膠片經考馬斯亮藍R-250染色,甲醇-冰乙酸脫色液脫色。最后經VILBER LOURMAT凝膠成像系統成像。

1.5 光譜測定

熒光光譜在Hitachi-850和Hitachi F-2500熒光光譜儀上測得。測定TNS的熒光時，激發波長選定320 nm，激發和發射狹縫均為10 nm，從350～600 nm記錄熒光發射譜。實驗均在室溫、10 mmol·L-1的Hepes、pH 7.4的條件下進行。為了便于不同滴定數據的對比并消除滴定中的稀釋效應，熒光變化用摩爾熒光強度Fluorescence/cprotein來表示。

2 結果與討論

2.1 變性膠電泳和天然膠電泳分析

N-D37K和N-D73K突變蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中 [圖2A(泳道1和2)]與野生型NEoCen[圖2A(泳道4)]有相同的遷移速率，所以在N端首個氨基酸突變后，分子量沒有大的改變，依然是10 kDa。與變性膠不同的是，N-EoCen[圖2B(泳道2)]比 N-D73K 和 N-D37K[圖 2B(泳道 1和 3)]更接近膠片的底部(在電泳體系中對應正極)，表明N-D37K和N-D73K比N-EoCen擁有更多的正電荷，由于天冬氨酸帶負電，而賴氨酸帶正電，這就證明得到了純度較高的N-D37K和N-D73K突變蛋白。

圖2 (A)15%變性膠分析，(1)N-D37K；(2)N-D73K；(3)EoCen；(4)N-EoCen；(5)Marker；(B)15%天然膠分析，(1)N-D73K；(2)N-EoCen；(3)N-D37KFig.2 (A)Purified N-D37K(1),N-D73K(2),EoCen(3),N-EoCen(4),Marker(5)monitored by 15%SDS-PAGE;(B)Purified N-D73K(1),N-EoCen(2),N-D37K(3)monitored by 15%native PAGE

2.2 中心蛋白的Tb3+熒光敏化

Tb3+是被廣泛應用的Ca2+結合蛋白的離子探針[20]。將Tb3+加入到蛋白溶液中，當酪氨酸或色氨酸在280 nm處激發時，在545 nm處可以檢測到Tb3+的敏化熒光。圖3是Tb3+在545 nm處的摩爾敏化熒光強度對r，即cTb3+/cprotein，所作的滴定曲線。從圖3中可以看到，對于N-EoCen和N-D73K，隨著前2個Tb3+的加入，其摩爾敏化熒光強度都得到增強，并且都在r=2時增強減弱，說明每個N-EoCen和ND73K都結合2個Tb3+離子，只是N-D73K的最大摩爾敏化熒光強度比N-EoCen降低了大約20%，而N-D37K的摩爾敏化熒光強度在r=1時增強減弱，說明每個N-D37K只結合1個Tb3+，且其最大摩爾敏化熒光強度大約只有N-EoCen的25%。這些結果表明當中心蛋白N端loopⅠ區的37位天冬氨酸突變為賴氨酸后，中心蛋白loopⅠ區喪失了金屬離子結合能力。

圖3 Tb3+分別滴定 N-EoCen(a)，N-D73K(b)和 N-D37K(c)蛋白的滴定曲線Fig.3 Titration curves for the addition of Tb3+to N-EoCen(a),N-D73K(b)and N-D37K(c),respectively

從八肋游仆蟲中心蛋白的一級結構可見，N端loopⅠ區37位天冬氨酸突變為賴氨酸后，loopⅠ區的凈電荷由-1變為+1，而金屬離子帶正電，由于排斥作用，導致LoopⅠ喪失了金屬離子結合能力。loopⅡ區73位的天冬氨酸突變為賴氨酸后，loopⅡ區的凈電荷由-3變為-1，仍能結合金屬離子，與實驗結果相吻合。N-D73K的敏化熒光強度相對于野生型N-EoCen有所降低，這可能是由于73位的天冬氨酸突變為賴氨酸后，Tb2-N-D73K與Tb2-NEoCen的三級結構不同所致。

2.3 Tb3+/Ca2+與N-D37K結合常數的計算

從N-D37K的Tb3+熒光滴定曲線 (圖3c)可以得知：一個N-D37K結合一個Tb3+，即n=1，用ct,Tb3+/cb,Tb3+對1/(nct,N-D37K-cb,Tb3+)作圖(圖 4)，按照(1)式[21]擬合。

其中ct,Tb3+，cb,Tb3+分別是鋱離子的總濃度和結合濃度，ct,N-D37K是N-D37K的總濃度。由圖4可得Tb3+與 loop Ⅱ的結合常數，KⅡ=(8.31±0.18)×104L·mol-1。

圖4 ct,Tb3+/cb,Tb3+對1/(ct,N-D37K-cb,Tb3+)作圖Fig.4 Plot of ct,Tb3+/cb,Tb3+versus 1/(ct,N-D37K-cb,Tb3+)

在Tb-N-D37K體系中，Ca2+的加入能使545 nm處鋱離子的敏化熒光猝滅。圖5是Ca2+滴定Tb-ND37K體系的熒光猝滅曲線，這種熒光猝滅來自于Ca2+和Tb3+與蛋白的競爭結合，即蛋白體系從ND37K-Tb轉化為N-D37K-Ca。鈣離子與N-D37K的loopⅡ的結合常數可以通過圖5和(2)式[21]擬合得到。

圖5 Ca2+滴定N-D37K-Tb的熒光競爭曲線Fig.5 Fluorescence quenching curve for the addition of Ca2+to N-D37K-Tb

所得Ca2+與N-D37K的loopⅡ的結合常數為KⅡ=(0.94±0.12)×102L·mol-1。

Tb3+和Ca2+與中心蛋白loopⅠ、loopⅡ的平均結合常數分別為 KⅠ,Ⅱ(Tb3+)=(2.13±0.10)×105L·mol-1和 KⅠ,Ⅱ(Ca2+)=(7.52±0.02)×102L·mol-1[21]，分別大約是N-D37K 的 loop Ⅱ結合常數 KⅡ(Tb3+)=(8.31±0.18)×104L·mol-1和 KⅡ(Ca2+)=(0.94±0.12)×102L·mol-1的 3倍和8倍。可以推斷Tb3+和Ca2+與中心蛋白loopⅠ的結合能力比loopⅡ大，中心蛋白N端半分子的2個金屬結合部位結合能力順序為Ⅰ＞Ⅱ。這與Ye等[22]提出的charge-ligand-balanced模型是一致的。

2.4 金屬離子誘導的蛋白構象變化

遠紫外圓二色譜可用于研究蛋白質的二級結構。圖6是N-EoCen，N-D73K和N-D37K在生理條件下的圓二色譜。可見突變體N-D73K、N-D37K的CD譜與N-EoCen幾乎完全重合，表明loop區天冬氨酸的突變沒有引起蛋白質二級結構發生大的變化。

圖6 N-EoCen、N-D73K和N-D37K的圓二色(CD)光譜Fig.6 Far-UV light CD spectra of N-EoCen and mutants

TNS是一種疏水熒光探針，它在水溶液中量子產率低，基本不發熒光，但在非極性溶液中或者和蛋白的疏水區結合后，其量子產率大增，熒光大大增強，最大熒光峰發生藍移[23]。將TNS分別加入到apoN-EoCen、Tb3+飽和 N-EoCen 以及 Ca2+飽和 NEoCen中，測得的熒光光譜如圖7A所示。可見蛋白質使TNS的最大熒光峰由500 nm藍移到435 nm，熒光強度增強；Tb3+飽和蛋白的增強效應遠大于Ca2+飽和蛋白的效應。表明N-EoCen結合金屬離子后暴露出疏水殘基、疏水面，即N-EoCen的三級結構在結合金屬離子后發生了改變。

用TNS分別滴定N-EoCen，N-D73K和N-D37K的空蛋白、Tb3+飽和蛋白以及Ca2+飽和蛋白，其435 nm處最大熒光強度如圖7B所示。從圖中可以看出，在沒有結合金屬離子時，空蛋白使TNS 435 nm處熒光增強，有少部分疏水表面的暴露，而且NEoCen，N-D73K和N-D37K的暴露程度也不相同，37位和73位天冬氨酸的突變導致疏水表面暴露程度減小，即突變在一定程度上改變了蛋白的三級結構；Tb3+飽和蛋白的疏水暴露程度大于Ca2+飽和蛋白，都遠大于空蛋白；結合金屬離子后，N-D37K的疏水暴露程度較N-EoCen和N-D73K都小得多。說明Asp37突變后，loopⅠ喪失了金屬離子結合能力,從而影響了中心蛋白依賴于金屬離子的構象變化。

圖7 (A)TNS熒光光譜：(a)只有TNS時；(b)加入apoN-EoCen 時；(c)加入 Ca2+-saturated NEoCen時；(d)加入Tb3+-saturated N-EoCen時； (B)Apo-protein，Ca2+-saturated protein 和Tb3+-saturated protein的熒光柱狀圖Fig.7 (A)Emission fluorescence spectra of TNS alone(a);in the presence of apoN-EoCen(b);Ca2+-saturated N-EoCen(c)and Tb3+-saturated NEoCen(d);(B)Plot of Fluorescence of apo-protein,Ca2+-saturated protein and Tb3+-saturated protein

3 結 論

中心蛋白發揮大部分生物功能都依賴于金屬離子，當中心蛋白loopⅠ區37位的天冬氨酸突變為賴氨酸后，loopⅠ喪失了金屬離子結合能力，進而影響了其依賴于金屬離子的構象變化。說明loopⅠ區37位的天冬氨酸在中心蛋白發揮生物功能時起著重要作用，是不可缺少的。而loopⅡ區73位的天冬氨酸突變為賴氨酸后仍保持金屬離子結合能力，依賴于金屬離子的構象變化減小。在10 mmol·L-1Hepes、pH 7.4、20 mmol·L-1KCl條件下，中心蛋白loopⅡ與Tb3+以及Ca2+的結合常數分別為KⅡ(Tb3+)=(8.31±0.18)×104L·mol-1和KⅡ(Ca2+)=(0.94±0.12)×102L·mol-1，N 端半分子的 2 個金屬結合部位的結合能力順序為：Ⅰ＞Ⅱ。

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Roles of Asp37 and Asp73 in the Loop of N-Terminal Domain of Ciliate Euplotes Octocarinatus Centrin

ZHAO BingDUAN Lian LIU Wen ZHAO Ya-Qin YANG Bin-Sheng＊
(Institute of Molecular Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

Ciliate Euplotes octocarinatus centrin (EoCen)is a member of the EF-hand superfamily of calciumbinding proteins,which often associated with the centrosomes and basal bodies.To explore the importance of Asp37 and Asp73 in the loop of N-terminal of EoCen,the mutants of N-D37K and N-D73K (D is aspartic acid,and K is lysine)were obtained by molecular biological methods.The experiments of aromatic residue-sensitized Tb3+energy transfer demonstrate that:N-D73K can bind two equivalents Tb3+,which is similar to N-EoCen(WTEoCen binds four equiv.Tb3+),and N-D37K can only bind one equivalent Tb3+.Using 2-p-toluidinylnaphthalene-6-sulfonate (TNS)as a hydrophobic probe,exposure of the hydrophobic surface upon metal binding was found to be significantly reduced for the metal ion-saturated N-D37K mutant.The results indicate that Asp37 plays an important role in the biological functions of N-terminal domain of EoCen.Meanwhile the conditional binding constants of the N-EoCen loop Ⅱ were quantitatively found to be KⅡ=(8.31±0.18)×104L·mol-1and KⅡ=(0.94±0.12)×102L·mol-1with Tb3+and Ca2+,respectively,and the order for the metal-binding affinity of the two sites in N-EoCen isⅠ＞Ⅱ.

centrin;N-terminal;Tb3+;Ca2+;TNS

O641.1；O614.341；O614.23+1

：A

：1001-4861(2011)02-0245-06

2010-09-06。收修改稿日期：2010-09-25。

國家自然科學基金(No.20771068；20901048)和山西省自然科學基金(No.20901048)資助項目。

＊通訊聯系人。 E-mail：yangbs@sxu.edu.cn