負載空間鏈四(6-氨基己酸磺酰基)鋁氯酞菁聚合物納米粒子的合成及其離體光動力活性

陳莉莉 彭亦如＊， 林萍萍 闕壽林 黃麗珊 陳奎治 徐國興

(1福建師范大學化學與材料學院，福州 350007)(2福建醫科大學附屬第一醫院，福州 350005)

負載空間鏈四(6-氨基己酸磺酰基)鋁氯酞菁聚合物納米粒子的合成及其離體光動力活性

陳莉莉1彭亦如＊，1林萍萍1闕壽林1黃麗珊1陳奎治1徐國興2

(1福建師范大學化學與材料學院，福州 350007)(2福建醫科大學附屬第一醫院，福州 350005)

以四磺酸鋁氯酞菁1為原料，采用氨基轉化法，經磺酰氯化和Hinsberg磺酰胺化反應合成四磺酰鋁氯酞菁2和四(6-氨基己酸磺酰基)鋁氯酞菁3，產物結構經元素分析，IR，1HNMR和MS-ESI表征。3在磷酸鹽緩沖溶液中與兩親嵌段共聚物聚乙二醇-聚-L-賴氨酸(PEG-b-PLL)通過靜電自組裝，形成負載3的聚合物納米粒子3/m。原子力顯微鏡(AFM)和透射電子顯微鏡(TEM)表明3/m具有球形核殼結構，直徑約為10～20 nm。紫外-可見吸收光譜和熒光光譜法研究了3/m的光物理性質。通過對不同孵育時間的人臍帶血內皮細胞(HUVEC)攝取藥代動力學測定3/m細胞攝取率和MTT法評價3/m的離體光動力活性，相對自由酞菁3，3/m的細胞攝取率大大提高，且提前1 h達到最高濃度，而且細胞抑制率明顯增大，約為3的2倍。

酞菁鋁；空間鏈；聚合物納米粒子；聚乙二醇單甲醚-聚-L-賴氨酸；合成；光動力活性

光動力療法是一種治療腫瘤及非腫瘤性疾病的新方法[1-3]。光動力療法的關鍵是光敏劑。迄今為止，酞菁配合物被認為是很有潛力的第二代光敏劑[3-4]。但是,由于酞菁分子間強的π-π疏水作用，導致它們容易聚集，從而降低其單線態和三線態氧的量子產率和熒光壽命，從而降低其光敏效果[5]。本課題組的主要研究工作是合成用于治療脈絡膜新生血管類疾病的酞菁光敏劑。考慮到在金屬酞菁配合物周邊引入長的空間鏈，不僅可以增加其作用范圍，而且其疏水的空間鏈也將有利于穿過細胞膜，提高光動力活性，同時，親水性的端基將有助于其與白蛋白結合和在體內運輸。此外，親水性端基還有助于其與帶有相反電荷的兩嵌段共聚物PEG-b-PLL通過靜電作用形成聚合物納米粒子[6-9]。

第二代光敏劑的主要缺點是對新生組織的選擇性較弱。第三代光敏劑是在第二代光敏劑上粘附或引入一些具有生物特性的化學裝置，這種 “化學裝置”可將光敏劑運輸或靶對指定的新生組織活細胞[10]，進一步提高了對新生組織的選擇性。目前可以作為化學裝置可以是脂質體、聚合物膠束和膠囊和蛋白質等等。

聚合物膠束已作為一種有效靶向新生組織的載藥方法引起國內外醫藥界人們的廣泛關注，特別是具有生物相容性和生物可降解性的兩親嵌段共聚物。兩親性嵌段共聚物在水溶液中自發組裝成具有核-殼納米膠束來完成對藥物的包裹和增溶[11]。當共聚物與藥物相互作用時，疏水鏈段與藥物通過疏水相互作用而聚集形成內核。親水性PEG在核的外圍形成欄柵狀殼，阻止疏水內核之間的相互作用。嵌段共聚物膠束尺寸可控制在10～200 nm，這種尺寸使納米粒子通透性好，能進入許多大粒子無法進入的組織或越過的屏障，在新生組織中富集。另外，帶有PEG殼的聚合物納米膠束已被證實能明確有效地富集在實體腫瘤中[12-13]。

鑒于上述考慮，本文設計合成了端基為親水羧基空間鏈為疏水性烷基的金屬酞菁配合物3，以兩親嵌段共聚物聚乙二醇單甲醚-聚L-賴氨酸(PEG-b-PLL)為藥物載體，其與3通過靜電自組裝形成負載3的聚合物納米粒子3/m。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

6-氨基己酸(深圳邁瑞爾化學技術有限公司)；33%溴化氫乙酸溶液(上海百靈威技術有限公司)；聚乙二醇單甲醚 (Fluka，A.R.)；Nε-芐氧羰基-L-賴氨酸(天津阿法埃莎化學有限公司)；三光氣(天津阿法埃莎化學有限公司)，四磺酸鋁氯酞菁由本課題組合成，其余試劑均為市售化學純和分析純。

Vario ELⅢ型元素分析儀(德國Element公司)；PE-983G型傅立葉紅外光譜儀(英國Perkin-Elmer公司)；UNITY500型核磁譜儀(美國 Varian公司)；LCQ Deca XP Max型質譜儀(美國 Finnigan公司)；Cary50型UV-Vis吸收光譜儀(美國 Varian公司)；FL900/FS920型穩態和瞬態熒光光譜儀 (英國Edinburgh分析儀器公司)；Nano Scope IIIa原子力顯微鏡(Digital Instrument公司)；JBM-1010透射顯微鏡(日本電子公司)。

1.2 實驗部分

3的合成路線如圖1所示。

圖1 3的合成路線Fig.1 Scheme for synthesis of compound 3

1.2.1 2 的合成[14]

氮氣保護下，在裝有氯磺酸(15 mL)的三頸燒瓶中緩慢加入 1(1 g，1.16 mmol)，混合均勻，在 135～150℃下攪拌回流6 h，冷卻至80℃后，緩慢滴加氯化亞砜(3 mL)，繼續反應3 h，冷卻至室溫，慢慢倒入250 mL冰水中，有大量的絮狀深藍色的沉淀產生，靜置，過濾，濾餅依次用稀鹽酸、水洗至溶液呈中性，過濾，真空干燥，得深藍色固體產物，產率90%。熔點大于350℃。

元素分析：按(C32H12N8S4O8Cl5Al·6H2O)的計算值(%):C(35.68)，H(2.25)，N(10.40); 實 際 值 (%):C(36.29)，H(2.54)，N(10.24)。

IR/cm-1:3 400，1 606，1 502，1 401，1 377，1 324，1 172，1 074，1 026，922，756，680。1H NMR(DMSO-d6,400MHz，δ/ppm)：9.86 (s,4H，ArH)，9.72 (s,2H,ArH)，9.63(s，2H，ArH)，8.69(s，4H，ArH)。 ESI-MS(m/z)：935[M+2H]-。

1.2.2 3 的合成

將 2(0.97 g，1 mmol)緩慢地加入到溶解 6-氨基己酸(1 g，8 mmol)的水溶液中，碳酸鈉調節pH值為8～9，室溫攪拌反應至無氣泡。 用 0.1 mol·L-1的稀鹽酸溶液調節pH值到7，旋轉蒸發，95%的乙醇水溶液重結晶2次，得深藍色固體，產率63%。熔點＞350 ℃。 元素分析：按(C56H60N12S4O16AlCl·2H2O)的計算 值(%)：C(48.60),H(4.66),N(12.15);實 際 值(%)：C(48.31),H(4.45),N(12.42)。

IR/cm-1：3 424,2 931,2 856,1 624,1 560,1 385,1318,1192,1143,1108,1028,922,835,690。

1H NMR (D2O,400MHz, δ/ppm)：8.2～10.0(m,12H,ArH),2.9(s,2H,CH2),2.17(s,2H,CH2),1.66(s,2H,CH2),1.57(s,2H,CH2),1.36(s,2H,CH2)。 MS(MALDI-TOF)(m/z),1346[M+1]+。

1.2.3 PEG-b-PLL 的合成

兩親嵌段共聚物聚乙二醇-聚L-賴氨酸按文獻[15-16]合成。IR/cm-1:3263，3050，2932，1967，1695，1 617，1 530，1 390，1 287，1 246，1 080～1 149，950，915， 884，778，709，627。1H NMR(D2O，400 MHz，δ/ppm)：4.7,4.3(t,α-CH)，3.7(m,CH2-CH2-O-,4H)，3.0(t,ε-CH2)，1.7～1.4(m,β-CH2，γ-CH2和 δ-CH2)

1.2.4 3/m 的制備

用Na2HPO4(10 mmol)溶液配制成3的濃度為1×10-5mol·L-1, 取 13.8 mL 該溶液， 然后加入溶有10 mg PEG-b-PLL 的 6.2 mL NaH2PO4(10 mmol)溶液，混合均勻。混合后溶液的pH值為7.4。

1.2.5 形態觀察

將少量自組裝后樣品滴加到云母片上，自然風干，采用Nano Scope IIIa原子力顯微鏡觀察樣品的形貌。

將少量自組裝后樣品滴加到銅網上，采用JBM-1010透射電鏡觀察樣品形貌。

1.2.6 紫外-可見吸收光譜

25℃下， 以 pH=7.4的 NaH2PO4-Na2HPO4(PBS)緩沖溶液為溶劑，190～900 nm掃描樣品吸收光譜。

1.2.7 熒光光譜性質

25℃下，以PBS 緩沖溶液為溶劑，以610 nm為激發波長，觀測酞菁體系在600～800 nm之間的發射光譜。通過氫氣納米閃爍燈采用350 nm波長激發，測定酞菁的熒光衰減曲線。熒光衰減曲線根據擬合方程 Fit=A+B1e-t/τ1+B2e-t/τ2+B3e-t/τ3+B4e-t/τ4進行雙曲線擬合得到熒光壽命。

1.2.8 3/m 細胞攝取藥代動力學

正常人人臍帶血內皮細胞(HUVEC)的培養方法見文獻[17]。

開啟紫外可見分光光度儀，先用2.0%TritionX-100 調零， 分別加入 10 μg·mL-13 和 3/m 1 mL，在300～800 nm進行吸收光譜掃描，找到吸收峰，然后在這個峰值作點掃描，分別做出一條標準曲線。用傳至第三代的人的HUVEC細胞，置六孔板培養，每孔1.0 mL， 細胞密度為 5×106mL-1， 酞菁終濃度為20 mol·L-1，對照組加入同體積的PBS溶液，37℃，5%CO2，飽和濕度的 CO2培養箱中避光孵育。0.5、1、2、3、4 h各收集一組細胞(各組設 3個平行孔)。 用PBS洗滌細胞2次后，加入1 mL細胞裂解液(2.0%TritionX-100)，吹打混勻，光學顯微鏡下檢測未見完整細胞。細胞裂解產物于低溫離心機4℃，高速離心30 min，取上清，用紫外可見分光光譜儀檢測細胞內酞菁的量。

1.2.9 離體光動力效果評價

1.2.9.1 PDT 處理

用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液重懸HUVEC細胞，密度為1×106mL-1，加入終濃度為10 μg·mL-1的3和3/m，孵育4 h后光照；光照條件：由LD-670半導體激光機(由天津醫科大學激光醫學研究室研制)輸出的670 nm激光以600 mW·cm-2的功率密度，按能量密度為50 J·cm-2照射。同時設立光對照組(不加光敏劑，加入相同體積PBS，孵育 4 h后光照)、含10 μg·mL-13和 3/m 的對照組(僅與光敏劑孵育4 h，不光照)。

1.2.9.2 MTT 比色法

即PDT處理后的HUVEC細胞，接種于96孔培養板，每組設3個平行孔，實驗重復3次。置37℃，5%CO2，飽和濕度的CO2培養箱中孵育48 h，用氮藍四唑鹽(MTT)比色法檢測HUVEC細胞的增殖能力。步驟如下：吸去含有胎牛血清的培養液，每孔加入 20 μL MTT(5 mg·mL-1)，加無血清培養基至200 μL 培養 4 h 后，棄上清，加入 20 μL DMSO 溶解結晶。在酶標儀上用波長490 nm測OD值，計算抑制率I。

2 結果與討論

2.1 合成條件

2的合成是本實驗的關鍵。在氯磺化反應中，1與氯磺酸的物質的量比不同，生成含不同取代基數目的酞菁磺酰氯的混合物。為了使反應進行完全，在反應后期加入二氯亞砜。實驗中考察了反應溫度和反應時間對2收率的影響，結果表明，合成2的最佳反應條件為135～150℃。3的合成反應機理為SN2親核取代。水溶液中該反應存在競爭性的水解反應，為防止同時發生氨化和水解反應，2應緩慢加入溶液中，需控制pH=8～9，且溫度低于25℃。

2.2 形態表征

圖2為兩親嵌段共聚物PEG-b-PLL在水溶液中自組裝形成聚合物納米膠束的AFM和TEM圖，膠束呈現球形，直徑約20～60 nm。

圖2 PEG-b-PLL的AFM圖(A)和TEM圖(B)Fig.2 AFM(A)and TEM(B)images of PEG-b-PLL

圖3是3/m的AFM和TEM圖，負載3的聚合物納米粒子呈球形,從放大圖可看出具有明顯的核殼結構,直徑約為10～20 nm。

圖3 3/m的AFM圖(A)和TEM圖(B)Fig.3 AFM(A)and TEM(B)(The enlarged image was inserted)images of 3/m

2.3 紫外-可見吸收光譜

2.3.1 AlPc(COOH)4和配合物 3 在水溶液中的紫外-可見吸收光譜

圖4為配合物3和無空間鏈取代酞菁AlPc(COOH)4在水溶液中的UV/Vis圖。3的Q帶最大吸收峰位于682 nm。在水溶液中，3主要以單體形式存在，而AlPc(COOH)4則以單體和二聚體共存形式存在。因此，相對AlPc(COOH)4，3在水溶液中的聚集效應明顯降低，這說明空間鏈在一定程度上可以有效阻止聚集體的形成。

2.3.2 3和 3/m 的紫外-可見吸收光譜

圖5(A)為3和3/m的紫外-可見吸收光譜圖，酞菁3在Q帶出現2個吸收峰，分別位于682和645 nm。其中682 nm為單體吸收峰，而645 nm為二聚體吸收峰，表明3在水溶液中主要以單體形式存在。而形成聚合物納米粒子后，只有一個吸收峰，即最大吸收峰位于644 nm，表明3在聚合物膠束內主要以二聚體形式存在[5,18]，而且相對3的二聚體吸收峰，3/m的吸收峰藍移。這可能是由于3與嵌段共聚物之間存在相互作用形成聚合物納米粒子。形成聚合物納米粒子后，酞菁在膠束內的局部濃度過大，因此酞菁主要以二聚體形式存在。

圖4 3(a)和AlPc(COOH)4(b)在水溶液中的UV-Vis吸收光譜Fig.4 UV/Vis spectrum of 3(a)and AlPc(COOH)4(b)withdifferent concentration in water.From up to down,the corresponding concentration(μmol·L-1)is 40,60,80,100,120,140,respectively

2.4 熒光光譜

圖5(B)和5(C)分別為3和3/m的熒光光譜圖和相應的熒光衰減曲線圖。從圖5(B)可以看出，將3包裹進入聚合物納米載體后，3/m的熒光強度大大降低,這可能是由于形成聚合物納米粒子后，每個聚合物納米粒子中包含的酞菁數目增多，酞菁的局部濃度過大，使得二聚體數目增加，熒光強度急劇下降。但是，形成聚合物納米粒子后，酞菁分子間非輻射能量轉移效應降低，單線激發態壽命從5.18 ns增加到5.36 ns。

圖5 3(-)和3/m(--)在PBS緩沖溶液中的紫外-可見吸收光譜(A)、熒光光譜(B)、熒光衰減曲線(C)Fig.5 UV/Vis spectra(A)，fluorescence spectra(B)and fluorescence decay curves(C)of 3(-)and 3/m(--)

2.5 不同孵育時間HUVEC細胞攝取3和3/m的藥代動力學

從圖6可以看出，與自由酞菁3相比，聚合物納米粒子3/m的細胞攝取率大大提高，而且提前1 h達到最高濃度。

圖6 不同孵育時間HUVEC細胞攝取3(■)和3/m(●)的量Fig.6 Time-dependent uptake amount of 3(■)and 3/m(●)in HUVEC cell

2.6 離體光動力活性

HUVEC細胞的離體光動力效果通過MTT法測定。表1為細胞存活率與光動力條件的關系。3和3/m在黑暗條件下幾乎沒有毒，相對自由酞菁3，3/m的細胞抑制率明顯增大，其離體光動力活性約為3的2倍。這可能是由于形成的聚合物納米粒子小，通透性好，能進入許多大粒子無法進入的組織或越過的屏障，能明確有效地富集在HUVEC細胞中[12-13,19]。

表1PDT后48 h HUVEC細胞的MTT法檢測結果Table 1 Results of MTT method in 48 h after PDT of HUVEC cells

續表1

3 結 論

合成并表征了一種新型空間鏈取代四(6-氨基己酸磺酰基)鋁氯酞菁3。3在PBS緩沖溶液中與PEG-b-PLL通過靜電作用自組裝成聚合物納米粒子3/m。3/m為具有核殼結構的直徑約為10～20 nm的球形納米粒子。與自由酞菁3相比，形成負載3的聚合物納米粒子后，3/m主要以二聚體形式存在，熒光強度降低，熒光壽命增長。將3包裹進入聚合物納米膠束后，不同孵育時間HUVEC細胞攝取率大大提高，細胞光動力活性顯著增加。這說明通過靜電作用自組裝形成的聚合物納米粒子3/m在光動力治療藥物的應用方面比自由金屬酞菁3具有更顯著的離體光動力療效。

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Synthesis of Polyion Micelle Incorporating Tetra-(6-carboxylic aminohexanoicsulfonyl)Phthalocyanine Aluminum(Ⅲ)and Its in vitro Photodynamic Therapy Efficacy

CHEN Li-Li1PENG Yi-Ru＊,1LIN Ping-Ping1QUE Shou-Lin1HUANG Li-Shan1CHEN Kui-Zhi1XU Guo-Xing2
(1College of Chemistry and Materials Science,Fujian Normal University,Fuzhou 350007,China)(2Affiliated First Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China)

Tetrachlorosulfonyl phthalocyanine aluminium (2)and tetra (6-carboxyl-aminohexanoicsulfonyl)phthalocyanine aluminium (3)were synthesized from (1)via sulfonylic chlorization and amidation reaction.The structures of above compounds were characterized by1H NMR,IR,MS and elemental analysis.The polymeric micelle (3/m)was formed via an electrostatic interaction of anionic phthalocyanine aluminum and poly(ethylene glycol)-poly(L-lysine)block copolymers(PEG-b-PLL)in PBS buffer solution.AFM and TEM showed that 3/m formed spherical nanoparticles with a diameter of 10～20 nm.The photophysical properties of 3/m were changed compared to that of compound 3.The time-dependent uptake amount of 3/m in HUVEC cell showed that the uptake amount of 3/m was significantly increased and reached peak value by ahead of an hour compared with that of 3.The in vitro photodynamic therapy efficacy of 3 and 3/m were evaluated by MTT methods.The results indicated that the in vitro photodynamic therapy efficacy of 3/m was ca.2 fold compared to that of free phthalocyanine 3.

phthalocyanine aluminium;spacer chain;polyion micelle;poly(ethylene glycol)-poly(L-lysine)diblock copolymer;synthesis;photodynamic therapy efficacy

O611.4；R979.1

：A

：1001-4861(2011)02-0327-06

2010-06-28。收修改稿日期：2010-08-12。

國家自然科學基金(No.20604007)、福建省自然科學基金(No.2008J0078)和衛生部科學研究基金(No.WKJ2008-2-61)和福建省科技廳重點項目(2007I0013)資助項目 。

＊通訊聯系人。 E-mail：yirupeng@fjnu.edu.cn