Ad-siICOS-EGFP阻斷ICOS共刺激通路抑制角膜移植急性排異反應

袁 偉，陸曉和，宮玉波，周 瑾

免疫排斥反應是導致角膜移植尤其高危角膜移植失敗的主要原因。深入探討排斥反應發生機理，通過多種手段及途徑抑制角膜移植免疫排斥反應的發生，仍是眼科領域關注的焦點之一。近年來，利用基因治療技術將抑制免疫排斥反應的基因轉入角膜防治移植免疫排斥反應成為很有希望的新手段，其中，RNA干擾（RNAi）作為一種新興的基因阻斷技術，以其簡單、有效、特異地下調細胞中基因的表達等優勢，在人類基因功能研究、基因治療方面已顯示出巨大的前景[1-3]。

本研究利用RNA干擾及轉基因技術，采用球結膜下注射途徑，將攜帶有報告基因GFP的針對大鼠共刺激分子ICOS為目的基因的Ad-siICOSEGFP應用至大鼠同種異體穿透性角膜移植模型，觀察Ad-siICOS-EGFP對大鼠植片存活時間的影響、抑制大鼠角膜移植急性免疫排斥反應的效果，初步探索以ICOS為目的基因的RNAi技術用于防治角膜移植免疫排斥反應的可行性及有效途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級Wistar大鼠30只為供體，SD大鼠60只為受體，雌雄不限，體質量200～250 g，鼠齡2～3個月，南方醫科大學實驗動物中心提供（實驗動物質量許可證號：0033674）。動物飼養溫度為 22～25℃，濕度為（50±5）%。

1.2 主要試劑 Ad-siICOS-EGFP（攜帶報告基因綠色熒光蛋白且表達ICOS-siRNA的重組腺病毒載體）溶液（北京本元正陽基因有限公司提供），物理滴度：3.7×1011v.p./ml；Ad-EGFP（攜帶報告基因綠色熒光蛋白的重組腺病毒）溶液（北京本元正陽基因有限公司提供）， 物理滴度：2.3×1011v.p./ml；30 g/L戊巴比妥鈉溶液（南方醫院實驗動物中心提供）。

1.3 方法

1.3.1 球結膜下注射 腹腔注射30 g/L戊巴比妥鈉溶液1.5 ml/kg麻醉，縫線開右瞼，在手術顯微鏡下，選取角膜緣12點位、6點位處2個注射點，以微量進樣器于近角膜緣球結膜下分別進行注射溶液，注射時緩慢推注溶液，使其在球結膜下彌散。

1.3.2 動物模型的建立及手術方法 以Wistar大鼠為供體，SD大鼠為受體，參照文獻[4]方法。術前20 min以0.5%托品酰胺滴眼液散瞳，腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液1.5 ml/kg麻醉。術前消毒，常規無菌操作，在手術顯微鏡下進行。首先于供體角膜中央區鉆取直徑為3.5 mm植片，置于Healon中備用。在受體大鼠右眼行穿透性角膜移植術。做上下眼瞼牽引線，用直徑3.0 mm環鉆鉆取中央區角膜，將植片置于植床，以10-0尼龍絲線間斷縫合8針，線結暴露不包埋。手術做部分改進，以粘彈劑Healon代替平衡鹽液，維持前房。術畢散瞳，結膜下注射慶大霉素2000 U，結膜囊涂四環素眼膏，縫合瞼緣。24 h后，拆除瞼緣縫線觀察角膜植片情況。角膜縫線在整個觀察期內不拆除。

1.3.3 實驗分組 根據注射途徑和注射溶液的種類不同進行分組。所有受體大鼠隨機分為以下3組，每組20只鼠：A組為單純角膜移植對照組；B組為Ad-siICOS-EGFP注射組，術后即刻于每個球結膜注射點分別注射 Ad-siICOS-EGFP15 μl；C 組為Ad-EGFP注射組，術后即刻于每個球結膜注射點分別注射 Ad-EGFP15 μl。

1.4 術后裂隙燈觀察及評分 術后第1天開始在裂隙燈顯微鏡下進行臨床觀察，參照Larkin等[5]的評分標準，記錄每日排斥反應指數（rejection index，RI），當RI＞5或植片混濁一項達到 3時，即認為排斥反應發生。

1.5 術后取材及處理 各組大鼠分別于術后第5天隨機取10只大鼠，麻醉后取角膜，部分行RTPCR檢測；部分角膜冰凍切片行共聚焦顯微鏡觀察。各組其余大鼠進行角膜植片存活時間統計。

1.6 共聚焦顯微鏡觀察GFP表達情況 摘取角膜后，冰凍切片機連續切片，厚度8 μm，激光共聚焦顯微鏡觀察熒光表達，以藍光激發GFP，觀察并攝片。

1.7 統計學方法 實驗數據以均數±標準差表示，應用SPSS13.0統計軟件包進行處理。統計方法：四組均數比較應用單向方差分析（one-way ANOVA），樣本均數間的多重比較采用LSD法。

2 結 果

2.1 術后裂隙燈觀察及植片存活時間 60只SD大鼠接受同種異體穿透性角膜移植手術。其中52只大鼠角膜移植術后術眼前房形成良好，晶狀體透明，未見手術并發癥。8只被排除于觀察組外，其中5只為術中麻醉意外死亡，1只術后出現前房消失，2只出現并發性白內障。均當即補充實驗動物。各組植片平均存活時間：A 組（9.800±0.632） d；B 組（14.700±1.418） d；C 組（10.000±1.054）d。 各組間角膜植片平均存活時間比較，有統計學差異 （F=52.383，P=0.000）。多重比較結果：B組與其余各組相比均有統計學差異 （P值均<0.05）；A組、C組組間無統計學差異。B組角膜植片平均存活時間最長。

2.2 共聚焦顯微鏡觀察GFP表達情況 球結膜下注射Ad-siICOS-EGFP組 （B組）及球結膜下注射Ad-EGFP組（C組）角膜植片可見綠色熒光表達，表達位于角膜上皮層及整個角膜基質層（圖1）。A組角膜植片未見綠色熒光表達。

圖1 GFP熒光蛋白在B、C組角膜上皮層及基質層的表達（×400）

3 討 論

角膜移植的免疫排斥反應主要是T細胞介導的遲發性超敏反應，隨著分子生物及免疫學的不斷發展，對其具體機制有了一定的認識，但仍尚未完全闡明。T細胞的活化需要兩種不同的刺激信號[6]，第一信號由抗原呈遞細胞（antigen presenting cell，APC）MHC-抗原肽復合物和T細胞上的TCR-CD3結合提供；第二信號即共刺激信號，由APC表面表達的共刺激分子與T細胞上的相應受體作用產生。目前已知的共刺激分子有多種，主要是B7家族成員和CD28家族成員，可誘導共刺激分子（inducible costimulator，ICOS）是 CD28 家族的新成員，有實驗表明，ICOS/ICOSL共刺激通路與大鼠角膜移植免疫排斥反應有密切關系[7]。

RNA干擾 （RNAi）是一種新興的基因阻斷技術，具有能夠簡單、有效、特異地下調細胞中基因的表達等特點，廣泛應用于多種疾病的研究中[8]。故本研究利用RNA干擾及轉基因技術，將針對大鼠共刺激分子ICOS為目的基因的Ad-siICOS-EGFP采用球結膜下注射的方式轉染至大鼠同種異體穿透性角膜移植模型，觀察Ad-siICOS-EGFP對大鼠植片存活時間的影響，推斷阻斷ICOS共刺激通路抑制大鼠角膜移植急性免疫排斥反應的效果，初步探索以ICOS為目的基因的RNAi技術用于防治角膜移植免疫排斥反應的可行性及有效途徑。

本實驗建立大鼠同種異體穿透性角膜移植模型，設立單純角膜移植組、球結膜下注射AdsiICOS-EGFP組、球結膜下注射Ad-EGFP組。研究發現：球結膜下注射Ad-siICOS-EGFP組角膜植片存活時間最長，與其他各組相比均有統計學差異，但植片仍不能長期存活。

以上結果說明，Ad-siICOS-EGFP可以通過阻斷ICOS共刺激通路，一定程度上抑制角膜移植急性免疫排斥反應，保護角膜移植物。但研究也發現，球結膜下注射Ad-siICOS-EGFP組受體鼠移植角膜未能長期存活，說明角膜移植排斥反應是一個多因素參與的復雜過程，共刺激途徑多樣化，單純阻斷ICOS一個共刺激通路雖然能夠較好的抑制急性排斥反應的發生，延長移植物存活時間，但不足以誘導穩定、持久的免疫耐受，植片未獲得長期存活。更有效的抑制大鼠角膜移植免疫排斥反應的方法仍有待進一步研究。

[1]Annette Busch,Wayne A Marasco,Cornelia Doebis,et al.MHC class I manipulation on cellsurfaces by gentransfer of anti-MHC class I intrabodies-a tool for decreased immunogenicity of allogeneic tissue and cell transplants[J].Method,2004,34:240-249.

[2]Comer RM,King WJ,Ardjomand N,et al.Effect of administration of CTLA4-Ig as protein or cDNA on corneal allograft survival[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2002,43(6):1095-1103.

[3]Sato Y,Ajiki T,Inoue S.Gene silencing in rat-liver and limb grafts by rapid injection of small interference RNA[J].Transplantation,2005,27(79):240-243.

[4]Williams KA，Coster DJ.Penetrating corneal transplantation in the inbred rat:a new model.Invest Ophthalmol Vis Sci，1985，26(1)：23-30.

[5]Larkin DFP，Calder VL，Lightman SL.Identification and characterization of cells infiltrating the graft and aqueous humor in rat corneal allograft rejection[J].Clin Exp Immunol，1997，107(4)：381-391.

[6]Djukanovic R.The role of costimulation in airway inflammation[J].Clin Exp Allergy,2000,30(suppll):46-50.

[7]袁 偉，陸曉和，宮玉波，等.ICOS共刺激通路參與角膜移植免疫排斥反應的研究[J]. 眼科研究，2009，（4）：27.

[8]Storz G.An expanding universe of noncoding RNAs[J].Science,2002,296(5571):1260-1263.