TGF-β1及WTp53在乳腺癌組織中的表達及其臨床意義

王 媛，王 坦，王 玉，楊廷桐

研究表明乳腺癌的發生是基因調控失衡的結果，其生物學特性與多種癌基因的作用密切相關，TGF-β1有促進腫瘤侵襲，轉移，上皮間葉轉化（EMT）[1]，血管增生以及免疫抑制等多種作用。野生型p53（wt-p53)具有顯著地腫瘤抑制作用，而突變型p53（mp-53）則具有致癌的作用。目前有關TGF-β1，wt-p53在乳腺癌的研究中極少報道。本研究運用血清學和免疫印跡技術分別檢測了TGF-β1，wt-p53基因在乳腺癌組織中的表達，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 2010-03～2011-04筆者所在醫院手術切除的標本，選取資料完整、病理組織學確診的乳腺癌48例，其中淋巴結轉移的31例，年齡31～62歲。并選取正常乳腺組織和癌旁組織作為對照。

1.1.2 主要試劑 兔抗人TGF-β1，p53多克隆一抗，羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗，TGF-β1分子量為23 kD，wp-53分子量為53 kD，β-actin分子量為42 kD。均購自武漢博士德生物工程有限公司，顯色劑購自北京中杉生物技術有限公司。ELISA檢測試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司。

1.2 方法 受試者抽取清晨空腹外周靜脈血3 ml，-4℃冰箱保存待檢測。采用ELISA法分別檢測TGF-β1，p53含量，嚴格按試劑盒說明進行操作。

1.2.1 組織中總蛋白提取及電泳 將液氮低溫保存的乳腺組織，腺癌及癌旁組織剪碎后各取100 mg，分別加入500 μl蛋白裂解液，4℃，15 000 r/min 勻漿后，2000 r/離心 15 min，上清移入另一管中，20 000 r/離心15 min，棄上清，取沉淀重新懸浮于200 μl勻漿緩沖液中，加蛋白提取液，充分混勻，沸水加熱變性10 min，應用蛋白分析試劑測定蛋白濃度。向加樣槽中加入各個樣品及蛋白標志物各25 μl，電壓75 V，電泳30 min。電泳完畢后取出凝膠，用電轉膜儀將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜，加封閉液封閉，室溫加第一抗體，二抗，顯色。

1.2.2 半定量結果分析 利用天能圖像分析系統對顯色結果拍照，記錄電泳條帶凈光密度和強度值，以目的基因與內參比值確定其含量計算其表達的相對豐度。

2 結 果

2.1 血液中TGF-β1，p53在正常人和乳腺癌患者中的含量比較 見表1。

表1 不同人血液中 TGF-β1，wt-p53 含量（±s，μg/L）

表1 不同人血液中 TGF-β1，wt-p53 含量（±s，μg/L）

正常人與乳腺癌患者相比，P<0.01

組別 n TGF-β1 wt-p53正常人 15 6.46±0.31 6.84±0.24乳腺癌患者 48 12.58±0.22 3.23±0.11Ⅰ～Ⅱ期 31 11.17±0.25 3.81±0.34Ⅲ～Ⅳ期 17 13.36±0.31 2.43±0.27

2.2 免疫印跡結果 TGF-β1在相對分子量23 kD處；wtp53在相對分子量53 kD處；β-actin在相對分子量 42 kD處；分別出現特異性條帶（圖1）。電泳條帶光密度值計算：目的基因/β-actin.正常腺體，炎癥和癌旁組織的 TGF-β1、wtp53表達無顯著性差異 （P>0105）；乳腺癌組織中TGF-β1、wt-p53表達與正常乳腺組織和癌旁組織相比有顯著性差異（P<0.01）；已有淋巴結轉移者 TGF-β1、p53 表達與無淋巴結轉移者相比有顯著差異（P<0.01）。見圖1，表2。

圖1 Western免疫印跡TGF-β1，p53表達

3 討 論

TGF-β1具有腫瘤抑制基因和癌基因的雙重角色，在信號轉導通路中的異常與腫瘤的發生、腫瘤細胞的浸潤及轉移密切相關[2]，TGF-β1在腫瘤的發生過程中激活上皮細胞周圍基質，形成腫瘤相關基質，對具有促癌作用的基質環境的形成起著關鍵作用，并誘導促進上皮細胞向間葉轉化，使上皮細胞更具有活動能力，在細胞基質間自由移動極富有侵襲性[3]。近年國外研究顯示在胃癌，結直腸癌等腫瘤中發揮重要作用[4]。

表2 不同組織中TGF-β1、wt-p53蛋白產物光密度比值（±s）

表2 不同組織中TGF-β1、wt-p53蛋白產物光密度比值（±s）

正常與癌旁比較P>0.05；正常與癌組織和有淋巴結轉移相比P<0.01；有無淋巴結轉移相比P<0.01

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本實驗發現無論是在血清中還是在組織中TGF-β1的含量乳腺癌患者和乳腺癌組織中均比正常人和正常乳腺組織顯著增高，而且有淋巴結轉移者表達更高，推測TGF-β1的高表達與乳腺癌的發展相關，與乳腺癌更具有侵襲能力的生物學行為相關。TGF-β1可誘導促進乳腺癌細胞向間葉細胞轉化（EMT），增強了乳腺癌細胞的運動能力侵襲能力[5]。腫瘤侵襲轉移是多基因參與多步驟完成的復雜病理過程，但腫瘤細胞粘附能力減弱和運動能力增強是其轉移的首要條件和基礎。Yao等[6]在對卵巢癌細胞系的研究中發現TGF-β1參與卵巢癌細胞的上皮-纖維原細胞-成纖維細胞的轉變過程中 使其逐漸獲得了遷移特性。

p53基因（Wt-p53）定位于17q13.1上，編碼由393個氨基酸殘基組成的蛋白質p53蛋白，是一種抑癌基因，細胞凋亡過程被認為有賴于Wt-p53基因的存在[7]。Wt-p53則通過調節bcl-2，Caspase，Bax等基因表達，啟動細胞凋亡控制程序，在50%的腫瘤細胞中存在p53突變，是基因改變頻率最高的目標基因。Wt-p53基因發生突變時可產生突變型p53蛋白 （mt-p53），mt-p53可抑制Wt-p53活性或使之失活，而且p53突變體失去了誘導凋亡的功能從而引起細胞的轉化和癌變[8]。mt-p53起著原癌基因的作用穩定存在并在腫瘤細胞核內積累而引起細胞惡性增殖[9]，抑制細胞凋亡并促進細胞惡性轉化。在肺癌卵巢癌等組織中p53以突變型為主，子宮頸癌組中以Wt-p53為主，且表達顯著降低。Wt-p53半衰期短易失活，因此p53失活快是增加患子宮頸癌風險的原因之一[10]。在本實驗中Wt-p53的表達隨著乳腺癌的發展與轉移在血液和組織中越來越低。因此Wt-p53得缺失可能是乳腺癌生物學行為演變的一種發生機制，Wt-p53的缺失與乳腺癌進展相關。這一結論與Qian等在對前列腺癌的研究中所得的結論相符[11]。

本研究從血清學和免疫印跡的角度探討了TGF-β1，Wt-p53與乳腺癌發展轉移的關系。證明了TGF-β1升高和Wt-p53降低是乳腺癌發生，侵襲轉移的危險信號，可作為乳腺癌生物學行為和預后判斷的潛在指標。也可成為乳腺癌復發的血清學指標。以后注重在乳腺癌中TGF-β1調控機制和通路方面的研究。

[1]周庚寅，蔡永萍.上皮間葉轉化的研究進展[J].鄭州大學學報(醫學版)，2010，45(3)：353-356.

[2]Bac Ds，Blazanin N，Licata M，et al.Tumor suppresson and oncogene actions of TGFbeta1 occurearly in skin carcinogencs and arc mediated by Smad3[J].Mol Carcinog，2009，48(5)：441-453.

[3]Wang KS，Hu ZL，Li JH，et al.Enhancementofme-Tastatic and invasivecapacity of gastriccancer cells by Transforming growth factor-beta1[J].Acta Biochim Biophys Sin，2006，38(3):179-186.

[4]Coban S，Yksel O，Kokar MC，et al.Thesignifi-cance of serumtrans forming growth factor betaindetecting of gastrican dcoloncancers[J].Hepatogastrol enterology，2007，54(77)：14722-1476.

[5]Haase VH.Oxygen regulates epithelial-to-mesenchymal transition:insights into molecular mechanisms and relevance to disease[J].J Kidney Int，2009，76(5)：492-9.

[6]Yao Q，Qu X，Yang Q，et al.CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer[J].Oncol Rep，2009，22(3)：541-548.

[7]Nayak SK，Pancsar PS，Kumar H.p53-induced apoptosis and inhibitors of p53[J].Curr Med Chem，2009，16(21):2627-2640.

[8]Adhikari AS，Iwakuma T.Mutant p53 Gain of on cogenic function in vivo evidence mechanism of action and clinical implications[J].Fukuoka Igaku Zasshi，2009，100(6):217-228.

[9]Karim S，Ali A.Correlation of p53 over-expression and alteration in p53 gene detected by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism in adenocarcinoma of gastric cancer patients from India[J].World J Gastroenterol，2009，15（11）：1381-1387.

[10]Crinelli R，Bianchi M，Menotta M，et al.Ubiquitin over-expression promotes E6AP autodegradation and reactivation of the p53/MDM2 pathway in HeLa cells[J].Mol Cell Biochem，2008，318：129-145.

[11]Qian I，Hinrasawa K，Bostwick DG，et al.Loss of p53 and cmyc overrcpicsentation in stage T(2-3)N(1-3)M(O)prostate cancer ate potential markers for cancer progression[J].Mod Pathol，2002，15(1):35-44.