氣相色譜-質譜法同時測定茶葉中7 2種農藥殘留量

陳紅平，劉 新，汪慶華，蔣 迎

(中國農業科學院茶葉研究所，農業部茶葉質量監督檢驗測試中心，浙江 杭州 310008)

氣相色譜-質譜法同時測定茶葉中7 2種農藥殘留量

陳紅平，劉 新，汪慶華，蔣 迎

(中國農業科學院茶葉研究所，農業部茶葉質量監督檢驗測試中心，浙江 杭州 310008)

建立茶葉中有機氯農藥、擬除蟲菊酯農藥、有機磷農藥等72種農藥及其異構體多殘留的氣相色譜-質譜(GC-MS)分析方法。樣品加水潤濕后，乙腈均質提取，5g/100mL氯化鈉溶液與提取液經液液萃取后，再用Carbon/NH2小柱凈化，25mL乙酸乙酯-丙酮(1:1)淋洗。優化色譜條件，采用選擇離子監測(SIM)模式進行質譜檢測。分別在樣品中添加標準農藥樣品0.1、1.0mg/kg水平上進行添加回收率實驗，方法的回收率范圍為65.3%～142.3%，相對標準偏差為3.0%～20.6%(n=6)。以信噪比RSN=3計算各農藥的最低檢出限為0.01～0.08mg/kg范圍。該方法結果準確、重現性好，滿足茶葉中多種農藥殘留檢測要求。

茶；氣相色譜-質譜；農藥多殘留；液液萃取；固相萃取

茶葉作為全世界三大無酒精飲料之一，已經廣泛被人們所接受。茶葉中茶多酚、咖啡堿、多糖等有效成分具有抗癌[1-2]、抑制心血管[3]、延緩衰老[4]、抑制和抵抗病毒等功效[5]，因此，飲茶有益于身體健康。但是，為了防治和減少茶樹病蟲害的危害，化學農藥在茶園中得到廣泛使用，尤其是殺蟲劑農藥，農藥的使用一方面提高茶葉的產量，但殘留的農藥卻極大危害人的身體健康，并造成環境污染，危害生態環境。歐盟[6]、日本[7]等國家或地區對茶葉中農藥殘留做了嚴格要求，并制定了最大殘留限量(MRL)。2002年頒布的《中華人民共和國農業部公告》第199號，明確規定三氯殺螨醇、氰戊菊酯、甲胺磷、甲基對硫磷、久效磷等共計39種農藥不得在茶園中使用，同時，食品中農藥最大殘留限量還規定了茶葉中農藥最大殘留限量值[8]。

氣相色譜法是茶葉中農藥殘留檢測采用的主要手段。氣相色譜配備選擇型檢測器，如電子俘獲檢測器(electroncapture detector，ECD)、火焰光度檢測器(flame photomentric detector，FPD)、氮磷檢測器(NPdetector，NPD)等，對茶葉中殘留的有機氯農藥和擬除蟲菊酯農藥[9]、有機磷農藥[10-11]檢測具有準確性高、靈敏度高的特點，因此廣泛用于我國茶葉中農藥殘留日常檢測工作。但是，由于農藥理化性質的差異以及茶葉基質的干擾，使得氣相色譜法難以滿足一次性前處理、一次進樣分析多種不同種類農藥殘留量，導致農藥殘留檢測繁瑣、分析成本高等不利因素。氣相色譜-質譜法可以同時檢測茶葉中有機氯農藥[12]、擬除蟲菊酯農藥[13]、有機磷農藥和其他類型農藥[14]，氣相色譜-選擇離子監測-質譜聯用(gas chromatography with selected ion monitoring mass spectromentric detection，GC-SIM-MS)通過對農藥化合物目標離子的監測，使得農藥殘留檢測GCMS方法的進樣濃度達到10-15g級別[15-16]，滿足了茶葉中農藥最大限量值。本實驗采用固相萃取凈化茶葉中復雜基質，旨在建立茶葉中有機氯農藥、擬除蟲菊酯農藥、有機磷農藥等72種農藥及其異構體的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

綠茶、烏龍茶、紅茶以及普洱茶樣品來自抽檢樣品或茶葉公司送檢樣品。

乙腈、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷(色譜級) 美國Tedia公司；氯化鈉、無水硫酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉(分析純) 上海試四赫維化工有限公司；去離子水，電導率低于18mΩ；農藥標準樣品美國Sigma公司。

表1 72種農藥的色譜保留時間、時間片段、駐留時間、定性定量離子、回收率、變異系數及檢出限Table 1 Retention time, time segment, dwell time, qualitative and quantitative ions, recovery rates, relative standard deviations and detection limits of 72 pesticide residues

續表1

7890-5975氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)、J&W DB-5 毛細管色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm) 美國Agilent公司；6mL Carbon/NH2固相萃取柱 美國Varian公司；IKA T18高速均質儀 德國IKA公司；Gilson ASPEC Xli全自動固相萃取儀 法國吉爾森公司； R215旋轉蒸發儀瑞士公司。

1.2 色譜、質譜條件

色譜條件：載氣為高純氦氣(純度99.999%)，流速1.0mL/min；進樣方式為不分流進樣，0.75min后打開分流閥，進樣量1μL，進樣口溫度250℃，連接桿溫度280℃；柱溫起始溫度80℃，保持1min，以15℃/min速率升溫到180℃，保留2min，以5℃/min速率升溫到280℃保持10.333min。

質譜條件：EI源，70eV；離子源溫度：230℃，選擇離子掃描模式(SIM)，選擇離子參數見表1。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

茶葉(干樣)經粉碎后取(5.0±0.01)g于150mL燒杯中，加入5mL去離子水潤濕15min，再加入30mL乙腈，12000r/min均質2min，經濾紙過濾于125mL分液漏斗中，分別用10mL乙腈重復洗燒杯兩次，合并濾液于125mL分液漏斗中。

1.3.2 凈化

在1.3.1節分液漏斗中加入50mL 5g/100mL氯化鈉的磷酸緩沖液pH5.8，振蕩后靜置30min，使乙腈相與水相分層。取乙腈相于100mL雞心瓶中，在水浴溫度40℃，氣壓125MPa旋轉蒸發儀濃縮近干，乙酸乙酯-丙酮(1:1)定容至2mL。5mL乙酸乙酯-丙酮(1:1)活化Carbon/NH2固相萃取柱，加入以上定容的2mL液體，分別用25mL乙酸乙酯-丙酮(1:1)混合液以6mL/min速度洗脫，淋洗液濃縮近干，丙酮定容至1mL。

1.4 農藥標準樣品配制

固體標準樣品稱取(0.020±0.0001)g，有機磷農藥采用丙酮溶解后，丙酮定容至100mL容量瓶中；有機氯、擬除蟲菊酯農藥用正己烷溶解，定容至100mL。定量標樣均采用空白茶葉基質配制：用10μL自動進樣針取適量標準樣品加入至1mL空白基質中。

2 結果與分析

2.1 GC-MS條件優化

2.1.1 色譜條件

離子的掃描速度是影響目標化合物靈敏度與穩定性至關重要的一個參數，掃描速度越快，單位時間內采集點增加，穩定性增強，但靈敏度下降；反之，則靈敏度增加而穩定性下降，目標化合物采集點數要求在7個點以上才能獲得良好的穩定性。質譜參數中駐留時間決定了離子的掃描速度，因此，駐留時間的設置顯得尤為重要。總離子流圖保留時間分段有利于增加駐留時間從而獲得更佳的穩定性與靈敏度。

當采用升溫程序1(80℃起始溫度，保留1min，然后以15℃/min升溫到280℃)時，總離子流圖中各農藥色譜峰分離度差，保留時間相差太小，難以進行分段處理，如圖1a、1b所示。在保留時間10.0～12.2min時間段內，共有25個農藥組分(圖1a)，碎片離子為75個，將這些碎片離子設置為同一時間段進行掃描，以平均峰寬6s計算，單個離子掃描頻率為10計算，則平均單個碎片離子駐留時間為8ms。當采用升溫程序2(柱溫起始溫度80℃，保持1min，以15℃/min速率升溫到180℃，保留2min，以5℃/min速率升溫到280℃保持10.333min)時，在10.0～12.2min內只有兩個農藥色譜峰，以平均峰寬6s計算，單個離子掃描頻率為10計算，則平均單個碎片離子駐留時間為100ms。因此，時間分段進行離子掃描，增大了碎片離子的駐留時間。另外，當以升溫程序1時，甲基對硫磷、皮蠅磷、甲基嘧啶磷、殺螟硫磷、馬拉硫磷和毒死蜱含有碎片離子m/z(125±0.5)(圖1b)，這6個農藥的保留時間分別為11.545、11.742、11.861、11.897、11.975、12.157min，當采用m/z125離子進行定性定量分析時，農藥間的交叉干擾勢必引入誤差或誤判結果。采用升溫程序2，6種農藥的保留時間相差較大(表1)，有效的避免了農藥交叉干擾引入的誤差。

圖1 升溫程序1條件下總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograph determined at the conditions of programmed temperature 1

2.1.2 質譜條件

目標化合物定性定量離子的選擇決定了GC-MS檢測方法是否準確最為關鍵步驟。對于相對分子質量較小的離子(小于m/z50)容易造成背景干擾從而影響定性定量分析；另外對于一些柱流失碎片以及進樣隔墊引入的碎片離子不應作為定性定量離子，如m/z207、281、149等。為了保證準確的定性，采用離子豐度比和保留時間作為定性標準，當未知化合物與農藥標準品保留時間偏差小于0.05s。

對于某些含氯或溴原子的農藥，同位素碎片離子在質譜圖上會產生特征的離子簇，采用這些離子為掃描離子可提高定性的準確性。如有機氯農藥六六六的4個異構體，含有6個氯原子，它的碎片離子C6H4Cl3的同位素族的質荷比為m/z181、183、185、 187的豐度為27:27:9:1。把離子存儲窗口定位m/z181～183，六六六可產生強度相等的m/z181和m/z183兩個峰。當豐度比不符合規律時可以判斷由于樣品或柱流失產生了干擾，應當選擇其他離子進行鑒定，這樣就增加了鑒定的準確性[17]。

在實驗條件下得到的茶葉空白樣品、72種農藥茶葉基質混合標準溶液及加標茶葉樣品的總離子流色譜圖見圖2。

圖2 茶葉空白樣品、基質標樣、添加標準樣品SIM離子圖Fig.2 SIM chromatograph of blank sample, tea matrix with standards and the samples at the spiked level of 0.1 mg/kg

2.2 樣品前處理

茶葉為多年生木本植物，含有豐富的化學成分，如茶多酚、咖啡堿、氨基酸、色素及其他組分[18]，因此茶葉中農藥殘留檢測方法中凈化步驟尤為重要。對于烏龍茶、普洱茶等顏色較深的茶葉樣品在未經液液萃取時，旋轉蒸發儀濃縮時有氣泡形成，并難以將提取液(乙腈)濃縮近干，同時出現深顏色乳油狀物質，導致回收率非常低。Carbon/NH2固相萃取柱對于色素、咖啡堿以及氨基酸有較好的吸附作用[19-20]，茶葉樣品經Carbon/NH2固相萃取柱凈化后呈透明狀。二氯甲烷-丙酮(1:1)作為淋洗液對于大部分農藥的回收率在70%～130%，但二氯甲烷具有非常大的毒性，對檢測人員的身體傷害較大。乙酸乙酯-丙酮(1:1)替代二氯甲烷-丙酮(1:1)同樣可以達到回收率滿意的結果(表1)，因此，本實驗采用25mL乙酸乙酯-丙酮(1:1)淋洗、Carbon/NH2固相萃取柱凈化作為凈化手段。

2.3 方法準確性與精密度

本方法檢測的農藥中六六六、滴滴涕分別存在4種異構體，包括α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六和p,p＇-滴滴伊、p,p＇-滴滴滴、o,p＇-滴滴涕、p,p＇-滴滴涕。這兩種農藥的定量均采用相應的異構體標準樣品進行定量再進行加和計算總含量[21]。硫丹、氯菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氟氰戊菊酯、氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、氰戊菊酯等9種農藥的異構體定量采用異構體加和再進行定量分析[22-23]。

分別將0.5、5.0mg/L的標準溶液添加1mL于5.0g空白茶葉樣品中，進行回收率測試。每個樣品重復6次，計算相對標準偏差(RSD)，各農藥的平均回收率、RSD(表1)。方法平均回收率除甲胺磷65.3%、敵敵畏68.9%、乙酰甲胺磷66.7%、久效磷66.7%、亞胺硫磷143.2%和聯苯菊酯124.3%外，其他農藥的平均回收率均在70%～120%范圍內。方法RSD(RSD)除百菌清20.6%、久效磷17.8%和乙酰甲胺磷15.4%外，其他均在3.0%～15.0%范圍內。由表1可見，回收率范圍為65.3%～142.3%，相對標準偏差為3.0%～20.6%(n=6)，以RSN=3為計算方法，各農藥的最低檢出限(LOD)均在0.01～0.08mg/kg范圍內，滿足茶葉中農藥殘留限量檢測要求，均低于我國茶葉中農藥殘留最大限量標準和歐盟法令、日本肯定列表最大殘留限量值。

3 結 論

本實驗建立茶葉中72種農藥殘留GC-MS檢測方法。方法中各農藥的最低檢出限均低于我國茶葉中農藥殘留最大限量標準和歐盟法令、日本肯定列表最大殘留限量值。方法準確、簡單、可靠，能夠滿足我國茶葉中農藥殘留日常檢測工作要求。

[1] CHEN D, MILACIC V, CHEN M S, et al. Tea polyphenols, their biological effects and potential molecular targets[J]. Histol Histopathol,2008, 23(4): 487-496.

[2] CHUNG F L, SCHWARTZ J, HERZOG C R, et al. Tea and cancer prevention: studies in animals and humans[J]. J Nutr, 2003, 133(10):3268-3274.

[3] PETER J R, JESSICA E S, SUSAN V. Time for tea: mood, blood pressure and cognitive performance effects of caffeine and theanine administered alone and together[J]. Psychopharmacology, 2008, 195(4): 569-577.

[4] MANDEL S A, AMIT T, KALFON L, et al. Targeting multiple neurodegenerative diseases etiologies with multimodal-acting green tea catechins[J]. J Nutr, 2008, 138(8): 1578-1583.

[5] YE Pian, ZHANG Shuling, ZHAO Lei, et al. Tea polyphenols exerts anti-hepatitis B virus effects in a stably HBV-transfected cell line[J].Journal of Huazhong University of Science and Technology: Medical Sciences, 2009, 29(2): 169-172

[6] Official Journal of the European Union. Council directives 76/895/EEC,86/362/EEC, 86/363/EEC and 90/642/EEC on pesticides in products of plant origin, including fruit and vegetables, cereals and foodstuffs of animal origin[S]. 2002-06-11.

[7] 食品中農業化學品殘留限量編委會. 日本肯定列表制度[M]//食品中農業化學品殘留限量: 食品卷. 北京: 中國標準出版社, 2006.

[8] GB 2763—2005 食品中農藥最大殘留限量標準[S].

[9] 莫小榮, 鄭春慧, 陳建偉, 等. 濁點萃取-異辛烷反萃取-氣相色譜測定茶葉中擬除蟲菊酯農藥[J]. 分析化學, 2009, 37(8): 1178-1182.

[10] 陳紅平, 蔣迎, 汪慶華, 等. 氣相色譜法快速測定茶濃縮汁中10種有機磷農藥的殘留量[J]. 理化檢驗: 化學分冊, 2009, 45(5): 573-574;577.

[11] 李永庫, 李曉靜, 徐遠金. 固相萃取-毛細管氣相色譜法測定茶葉中11種有機磷農藥[J]. 理化檢驗: 化學分冊, 2008, 44(6): 563-565; 569.

[12] 趙瓊暉, 靳保輝, 謝麗琪, 等. 氣相色譜-質譜法測定茶葉中的25種有機氯農藥殘留[J]. 色譜, 2006, 24(6): 629-632.

[13] 侯英, 曹秋娥, 謝小光, 等. 應用攪拌棒吸附萃取-熱脫附-氣相色譜質譜法測定煙葉和茶葉中擬除蟲菊酯類農藥殘留[J]. 色譜, 2007,25(1): 25-29.

[14] 張均媚, 薛剛, 劉偉娟. 氣相色譜-質譜法測定茶葉中12種農藥殘留的方法[J]. 食品研究與開發, 2005, 26(3): 157-159.

[15] NGUYEN T D, YU J E, LEE D M, et al. A multiresidue method for the determination of 107 pesticdies in cabbage and radish using QuEChERS sample preparation method and gas chromatography mass spectrometry[J]. Food Chemistry, 2008, 110(1): 207-213.

[16] OKIHASHI M, KITAGAWA Y, AKUTSU K, et al. Rapid method for the determination of 180 pesticide residues in foods by gas chromatography/mass spectrometry and flame photometric detection[J]. J Pestic Sci,2005, 30(4): 368-377.

[17] 張偉國, 儲曉剛, 李重九. 氣相色譜/離子阱質譜-選擇離子方法同時檢測大米中百種農藥殘留[J]. 分析化學, 2006, 34(4): 484-488.

[18] 宛曉春. 茶葉生物化學[M]. 3版. 北京: 中國農業出版社, 2007.

[19] 朱莉萍, 朱濤, 潘玉香, 等. 氣相色譜法同時測定蔬菜及水果中多種農藥殘留量[J]. 分析化學, 2008, 36(7): 999-1003.

[20] 樓正云, 陳宗懋, 羅逢建, 等. 固相萃取-氣相色譜法測定茶葉中殘留的92種農藥[J]. 色譜, 2008, 26(5): 568-576.

[21] HUANG S P, HUANG S D. Dynamic hollow fiber protected liquid phase mcircoextraction and quantification using gas chromatography combined with electron capture detection of organochlorine pesticides in green tea leaves and ready-to-drink tea[J]. Journal of Chromatography A,2006, 1135(1): 6-11.

[22] MILLION B W, DANIEL R O. Pyrethroids, pyrrethrin, and piperonyl butoxide in sediments by high-resolution gas chromatography/highresolution mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2006,1135(1): 71-77.

[23] ISABEL P R, GIL-ALEGRE M E, ANA ISABEL T S. Development and validation of a fast high-performance liquid chromatography method for the determination of microencapsulated pyrethroid pesticides[J].Analytica Chimica Acta, 2006, 557(1/2): 245-251.

Simultaneous Determination of 72 Pesticide Residues in Tea by Gas Chromatography-Mass Spectrometry

CHEN Hong-ping，LIU Xin，WANG Qing-hua，JIANG Ying
(Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Tea Quality and Supervision Testing Center,Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China)

A gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) method was developed for the simultaneous determination of 72 pesticides and their isomers including organochlorine, pyrethriod, organophosphorus and other pesticides in tea. After moistened by water, the samples were subjected to extraction by acetonetrile, preliminary clean up by 5 g/100 mL sodium chloride,and further purification on carbon/NH2 column through the elution using 25 mL of ethyl acetate-acetone (1:1). The MS detection was performed in the selected ion-monitoring mode under the optimal chromatographic conditions. The recovery rates were determined in samples spiked at 0.1 mg/kg and 1.0 mg/kg. The overall recovery rates were 65.3%－142.3%, with a relative standard deviation (RSD) between 3.0% and 20.6%. The detection limit of this method was 0.01－0.08 mg/kg with a signal/noise ratio of 3. This developed method is characteristics of high sensitivity and accuracy, which is suitable for the simultaneous determination of pesticide residues.

tea；GC-MS；multiple residues；LLE；SPE

TS207.5

A

1002-6630(2011)06-0159-06

2010-04-15

現代農業產業技術體系建設專項(nycytx-26)

陳紅平(1 97 7—)，男，助理研究員，碩士，研究方向為農藥殘留、茶葉質量安全。E-mail：thean27@mail.tricaas.com