過氧化氫誘導HepG2細胞產生氧化應激細胞模型的建立

韓 飛，周孟良

(國家糧食局科學研究院，北京 100037)

過氧化氫誘導HepG2細胞產生氧化應激細胞模型的建立

韓 飛，周孟良

(國家糧食局科學研究院，北京 100037)

不同濃度過氧化氫作用人肝癌細胞(HepG2)4h后，用單細胞凝膠電泳技術測定DNA損傷狀況，分光光度法測定丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，研究過氧化氫的最佳作用濃度，構建體外氧化應激細胞模型。結果表明，過氧化氫的最佳作用濃度為100μmol/L，作用細胞的時間選擇4h，可以成功構建以過氧化氫為氧化應激誘導劑的HepG2細胞體外氧化應激模型。

過氧化氫；HepG2細胞；氧化應激模型

氧化應激是指細胞暴露于高濃度氧分子或氧的化學衍生物而引起的細胞損傷。自由基作用于生物大分子，破壞細胞結構，最終導致諸如動脈粥樣硬化、糖尿病、炎癥、衰老、癌癥等的發生發展[1]。建立成功可靠的氧化應激模型，對于揭示氧化應激機制以及研究和篩選抗氧化藥物和功能食品都有重要意義[2]。過氧化氫是一種重要的活性氧，極易透過細胞膜，與細胞內鐵離子通過Fenton反應形成高活性的自由基，導致一系列反應，其易于獲得，性質相對穩定，所以它已成為研究細胞氧化損傷的重要工具[3-4]。本研究以人肝癌細胞(HepG2)為基礎，以過氧化氫為氧化應激誘導劑構建體外氧化應激細胞模型。以單細胞凝膠電泳技術測定DNA損傷狀況以及分光光度法測定丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性以摸索過氧化氫的最佳作用濃度，構建體外氧化應激細胞模型，為后續研究篩選抗氧化劑的生物芯片實驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

HepG2(人肝癌細胞) 協和醫科大學。

青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺、胰蛋白酶 美國Sigma公司；DMEM培養基、胎牛血清 美國Gibco公司；H2O2、二甲基亞砜、EDTA、正常熔點瓊脂糖 北京化學試劑公司；MDA測定試劑盒、SOD測定試劑盒、GSH-Px活力測試盒 南京建成生物工程研究所；測定與分析用水均為超純水。

HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；101A-3B電熱鼓風干燥箱 上海安亭科學儀器有限公司；MCO-18AIC CO2培養箱 日本三洋公司；SW-GJ-2FD潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；液氮罐 美國Thermo公司；3K15冷凍離心機 美國Sigma公司；37XB倒置顯微鏡 上海光學儀器五廠；奧林巴斯IX71熒光顯微鏡 日本奧林巴斯株氏會社；PE Lambda35紫外-可見分光光度計 美國Perkin Elmer儀器公司；BIORAD電泳儀、BIO-RAD 680酶標儀 美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 肝癌細胞(HepG2)培養[5-7]

將HepG2細胞按5×105個/mL接種在含10% FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、10mmol/L Hepes緩沖液、2mmol/L L-谷氨酰胺(L-glutamine)的DMEM培養基中(pH 7.2)，37℃、5% CO2溫育。細胞為多角形貼壁生長，每2～3d傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 實驗分組及藥物處理

實驗分為4組，分別為正常對照組，加入常規培養液；H2O2處理組，加入培養液和H2O2，H2O2終濃度分別為10、100、1000μmol/L。

1.2.3 噻唑藍(MTT)法檢測細胞存活率[8]

取對數生長期HepG2細胞以105個/mL密度接種于96孔板上，共設4組，每組5孔，于37℃、5%CO2培養箱中培養24h后，去除培養液，同上加藥物處理，每孔100μL作用4h，然后每孔加入10μL 5g/L的MTT，溫育4h，去除培養液及MTT，每孔加入200μL二甲基亞砜，用酶標儀測定各孔在波長570nm處的吸光度。

1.2.4 單細胞凝膠電泳法檢測細胞DNA損傷[9]

取對數生長期的HepG2細胞以105個/mL密度接種于12孔板上，共設4組，于37℃、5%CO2培養箱中培養24h后，去除培養液，同上加藥物處理，每孔700μL作用4h，然后去除培養液，4℃ PBS洗一次，加入0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，1000r/min離心5min后收集細胞，用磷酸緩沖液(PBS)重懸，密度為1×105個/mL。將加熱溶解的0.8%正常熔點瓊脂糖(NMA)冷卻至45～60℃時，取120μL鋪于磨砂載玻片上，蓋上蓋玻片，4℃凝固10min。取100μL單細胞懸液與37℃等體積1%的低熔點瓊脂糖(LMA)混勻液，鋪于第二層膠上，蓋上蓋玻片，4℃固定15min后揭去蓋玻片，將膠板浸于4℃裂解液(含2.5mol/L NaCl、100mmol/L Na2EDTA、10mmol/L Tris，pH10.0，臨用前加10%的DMSO，1%的TritonX-100)中裂解1.5h。取出載玻片用蒸餾水輕柔漂洗2次，以免瓊脂糖脫落，然后將膠板浸于4℃電泳緩沖液(1mmol/L Na2EDTA、300mmol/L NaOH，pH13.0)解螺旋20min，電泳(17V，200mA)20min。電泳結束后，膠板用中和緩沖液(0.4mol/L Tris，pH7.5)中和兩次，每次10min，中和完全后用2μg/mL的EB 50μL染色5min，蒸餾水脫色10min。以上操作均在4℃暗處進行[10-11]。

熒光顯微鏡10×目鏡、20×物鏡下觀察結果(激發光波長510～560nm)及拍照。每組隨機選擇20個細胞計數，使用CASP軟件測量照片中尾矩(從彗星頭的右邊界到彗星尾部末端的距離與尾部DNA含量的乘積)和Olive尾矩(從頭光密度重心到尾光密度重心的距離與尾部DNA含量的乘積)這兩個指標，以反映細胞DNA的損傷程度。

1.2.5 MDA、SOD、GSH-Px的測定

取藥物作用的細胞，用PBS洗1遍，加入0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化，制成細胞懸液，4000r/min離心5min收集細胞，用PBS洗一遍，加入細胞裂解液(150mmol/L NaCl、150mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA、1% Triton X-100，pH8.0)使細胞裂解[12-13]，于4℃離心1h，以上清液作為樣本，參照南京建成生物工程研究所提供的相應試劑盒說明書測定細胞內MDA含量和SOD、GSH-Px活性。SOD活力單位定義為每毫克組織蛋白在1mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD酶活力為一個酶活力單位(U) ；GSH-Px活力單位定義為每毫克蛋白質每分鐘扣除非酶反應，使反應體系中GSH濃度降低1μmol/L為一個活力單位(U)。蛋白質定量采用考馬斯亮藍比色法測定。

1.2.6 統計分析

采用SPSS13.0統計軟件對數據進行方差分析，兩組間的數據比較采用t檢驗。實驗數據用±s的形式表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 過氧化氫對HepG2細胞存活率的影響

不同濃度的H2O2作用于HepG2細胞4h后，低濃度10、100μmol/L H2O2作用細胞存活率與正常對照組相比沒有顯著變化，500、1000μmol/L H2O2作用細胞存活率與正常對照組相比顯著降低，且隨著H2O2濃度的升高，細胞存活率逐漸降低(圖1)。

圖1 H2O2對HepG2細胞存活率的影響(±s，n=5)Fig.1 Effect of H2O2 on HepG2 cell survival (±s, n = 5)

2.2 過氧化氫對肝癌細胞DNA損傷的影響

不同濃度的H2O2作用于HepG2細胞4h后，與正常對照組比較，10μmol/L H2O2作用細胞，尾矩和Olive尾矩雖有增加，但無顯著差異，從圖中也未見其尾巴有顯著增長，100、1000μmol/L H2O2作用細胞，尾矩和Olive尾矩顯著增加，尾巴也出現顯著性增長，并隨著H2O2濃度的升高，尾矩和Olive尾矩也同時增長(圖2，表1)。Scolastici等[14]報道100μmol/L H2O2作用HepG2細胞DNA也出現顯著性損傷，然而細胞存活率沒有產生變化。

表1 H2O2對HepG2細胞DNA損傷的影響(±s，n=20)Table 1 Effect of H2O2 on DNA damage in HepG2 cell (±s, n = 20)

表1 H2O2對HepG2細胞DNA損傷的影響(±s，n=20)Table 1 Effect of H2O2 on DNA damage in HepG2 cell (±s, n = 20)

注：*.與正常對照組相比，差異顯著(P＜0.05)。

組別 尾矩 Olive尾矩正常對照組 1.60±2.20 2.31±2.27 10μmol/L H2O2組 3.03±2.45 3.74±2.52 100μmol/L H2O2組 27.08±8.90* 17.50±5.37*1000μmol/L H2O2組 35.40±7.35* 31.12±6.45*

圖2 熒光顯微鏡下DNA形態(×200)Fig.2 DNA observed under fluorescence microscope (×200)

2.3 過氧化氫對肝癌細胞MDA含量、SOD、GSH-Px活性的影響

表2 H2O2對HepG2細胞MDA含量、SOD及GSH-Px活性的影響(x± s，n=3)Table 2 Effect of H2O2 on MDA content, SOD and GSH-Px activities in HepG2 cell (x± s，n=3)

不同濃度的H2O2作用于HepG2細胞4h后，與正常對照組比較，10μmol/L H2O2作用細胞，MDA含量和SOD、GSH-Px活性都未發生顯著變化，100、1000μmol/L H2O2作用細胞，其值都發生了顯著變化。隨著H2O2濃度的升高，MDA含量也同時升高，而SOD和GSH-Px活性卻在同時降低(表2)。

3 討 論

一個好的模型必須具備特異性、模擬性和可控性。本實驗的目的是構建氧化應激的細胞模型，該模型在適宜濃度的H2O2誘導下，細胞的DNA被外泄、損傷，相關的基因表達發生變化，細胞內的脂質、蛋白質被損傷，但是這種損傷不會造成細胞死亡，而且在適宜的抗氧化劑的作用下，這些損傷還有可能被修復。由于4h是測量相關基因產生表達變化的最小共有間隔[15]，同時考慮到長時間的氧化作用會對細胞造成不可逆損傷甚至死亡[9]，因此過氧化氫作用細胞的時間選擇為4h。從實驗結果可見，當H2O2作用HepG2細胞濃度為100 μmol/L，作用時間為4h時，細胞存活率沒有顯著降低，而細胞DNA出現了顯著性損傷，尾矩和Olive尾矩顯著增加，尾巴也出現顯著性增長，且MDA含量、SOD、GSH-Px活性都發生了顯著變化，說明在此濃度下，HepG2細胞的細胞核內DAN已外泄，且細胞內的脂質和酶系都發生了顯著變化，但是這種損傷不會造成細胞死亡，因此過氧化氫的最佳作用濃度選為100 μmol/L。Farombi等[9]用同樣濃度的過氧化氫(100 μmol/L)處理肝細胞，利用單細胞凝膠電泳試驗觀察到DNA斷裂水平的增多，從DNA水平證明了過氧化氫氧化損傷模型可以提供一個較理想的抗氧化實驗平臺。鄭延松等[3]用低濃度過氧化氫(100 μmol/L)成功建立了心肌細胞氧化損傷模型，且實驗中發現，低濃度的過氧化氫隨著時間的延長可以表現出明顯的細胞損傷效應，先是細胞功能的改變，損傷積累到一定程度就觸發了細胞的器質性損害和不可逆損傷。

本實驗結果表明，過氧化氫作用濃度為100 μmol/L，作用時間4h，可以成功構建以過氧化氫為氧化應激誘導劑的HepG2細胞體外氧化應激模型。該模型的建立為揭示氧化應激機制以及研究和篩選抗氧化藥物和功能食品奠定了實驗基礎。

[1] 吳其夏, 余應年, 盧建. 病理生理學[M]. 北京: 中國協和醫科大學出版社, 2003: 247-270.

[2] 徐清萍, 鐘桂芳, 孟君. 抗氧化劑抗氧化方法研究進展[J]. 食品工程,2007(2): 23-25.

[3] 鄭延松, 李源, 張珊紅, 等. 用低濃度過氧化氫建立心肌細胞氧化損傷模型[J]. 第四軍醫大學學報, 2001, 22(20): 1849-1851.

[4] 張斌, 夏作理, 趙曉民, 等. 氧化應激模型的建立及其評價[J]. 中國臨床康復, 2006, 44(10): 112-114.

[5] 唐孟萱, 周萬軍, 胡元佳, 等. HepG2細胞培養方法與條件的探討[J].實用預防醫學, 2005, 12(1): 71-73.

[6] 張卓然. 實用細胞培養技術[M]. 北京: 人民衛生出版社, 1999.

[7] 甘起霓, 魯文清, 張悅. 人肝腫瘤細胞HepG2最佳培養條件探討[J].同濟醫科大學學報, 2001, 30(4): 319-320.

[8] MOORADIAN A D, HAAS M J, WADUD K, et al. Ascorbic acid and α-tocopherol down-regulate apolipoprotein A-I gene expression in HepG2 and Caco-2 cell lines[J]. Metabolism Clinical and Experimental,2006, 55(2): 159-167.

[9] FAROMBI E O, MOLLER P, DRAGSTED L O. Ex-vivo and in vitro protective effects of kolaviron against oxygen-derived radical-induced DNA damage and oxidative stress in human lymphocyles and rat liver cells[J]. Cell Biol Toxicol, 2004, 20: 1-12.

[10] MBA GACHOU C, LAGET M, GUIRAUD-DAURIAC H, et al. The protective activity of α-hederine against H2O2 genotoxicity in HepG2 cells by alkaline comet assay[J]. Mutation Research, 1999, 445: 9-20.

[11] 梁培禾, 靳風爍, 賈思遠, 等. 單細胞凝膠電泳技術操作[J]. 第三軍醫大學學報, 2001, 23(1): 116-117.

[12] 王璇, 黃波, 李東陽, 等. 鋅對人肝癌細胞氧化應激水平的影響[J].南華大學學報, 2007, 35(3): 338-340.

[13] 張明, 何衛紅, 何平, 等. 多溴聯苯醚對SH-SY5Y細胞氧化應激及凋亡的影響[J]. 中華勞動衛生職業病雜志, 2007, 25(3): 145-147.

[14] SCOLASTICI C, ALVES DE LIMA R O, BARBISAN L F, et al.Antigenotoxicity and antimutagenicity of lycopene in HepG2 cell line evaluated by the comet assay and micronucleus test[J]. Toxicology in Vitro, 2008, 22: 510-514.

[15] ANDREA L W, JAMES T H, LEONARD M H. Microarray analysis of H2O2-, HNE- or tBH-treated arpe-19 cells[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2002, 33(10): 1419-1432.

An Experimental HepG2 Cell Model of Hydrogen Peroxide Induced DNA Oxidative Injury

HAN Fei，ZHOU Meng-liang
(Academy of State Administration of Grain, Beijing 100037, China)

The oxidative effect of 4 h exposure to H2O2 at different concentrations on HepG2 cells was measured by determining DNA damage by single cell gel electrophoresis technique and assaying MDA content and the activities of SOD and GSH-Px in HepG2 cells. An experimental model of oxidative stress was established based on the optimal concentration of H2O2. The results showed that the optimal H2O2 concentration determined was 100μmol/L and construction of the HepG2 cell model of oxidative injury came to success after 4 h treatment with H2O2 at this concentration.

H2O2；HepG2 cell；oxidative stress model

Q505

A

1002-6630(2011)05-0055-03

2010-07-12

中央級公益性科研院所基本科研業務費專項基金項目(ZX0706)

韓飛(1973—)，女，副研究員，博士，主要從事糧油(食品)營養與功能研究。E-mail：hf@chinagrain.org