表面活性劑穩定性堿性蛋白酶純化及性質研究

高兆建，李 超，侯進慧

(徐州工程學院食品(生物)工程學院，江蘇 徐州 221008)

表面活性劑穩定性堿性蛋白酶純化及性質研究

高兆建，李 超，侯進慧

(徐州工程學院食品(生物)工程學院，江蘇 徐州 221008)

從地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)XG12發酵液中分離純化表面活性劑穩定性堿性蛋白酶，并對酶學性質進行研究。利用硫酸銨分級鹽析、DEAE-Sepharose陰離子交換層析和Sephadex G-75分子篩凝膠過濾層析等方法，分離純化到了均一的酶蛋白，酶純度提高了42.6倍，回收率為25.3%。SDS-PAGE及Sephadex G-75分子篩凝膠過濾層析顯示酶蛋白為單亞基蛋白，分子質量約為29.5kD。在pH7.0～11.0范圍內酶活性及穩定性較高，最適作用pH值為10.0，最適作用溫度40℃。Mg2+、Ca2+及Mn2+對酶有明顯激活作用。絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑強烈抑制酶活性，表明所純化到的蛋白酶為絲氨酸蛋白酶。酶分別對終質量濃度為0.1g/100mL的陰離子表面活性劑SDS、陽離子表面活性劑CTAB和體積分數為1%的非離子型表面活性劑Tween-80、Tween-20、Triton X-100以及氧化劑均具有很強的穩定性。

地衣芽孢桿菌XG12；堿性蛋白酶；分離純化；表面活性劑；酶學性質

蛋白酶是一類重要的工業水解用酶，年銷售量約占世界酶銷售總量的60%[1]，從工業用酶角度考慮，蛋白酶是最為重要的一類水解酶。它廣泛應用于工業生產的眾多行業中，如洗滌劑、食品加工、動物飼料、制藥、制革、診斷試劑、蠶絲脫膠、多肽合成及污水處理等領域[2-3]。具有重要工業應用價值的蛋白酶主要從微生物中獲得，而認為相對安全的芽孢桿菌屬和黑曲霉屬微生物是蛋白酶的主要來源。近年來，因芽孢桿菌屬微生物蛋白酶高產量、高穩定性等優勢，人們越來越傾向于芽孢桿菌屬蛋白酶的研究[4]。近年來已經從克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)[5]、莫哈韋芽孢桿菌(Bacillus mojavensis A21)[6]、嗜鹽芽孢桿菌(haloalkaliphilic Bacillus sp.)[7]等芽孢桿菌屬微生物中分離到表面活性劑穩定性蛋白酶。這些蛋白酶能否在食品加工以及其他行業中使用還受到諸多因素的限制，如環境pH值、溫度、氧化劑以及金屬離子等對蛋白酶活性及穩定性的影響。

本實驗室分離到一株產生表面活性劑穩定性蛋白酶的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)XG12，初步研究發現該菌株所產蛋白酶穩定性較好。地衣芽孢桿菌表面活性劑穩定性絲氨酸堿性蛋白酶的研究在國內外尚未見同類報道。本研究報道了該酶的分離純化和酶學性質。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DEAE-Sepharose、Sephadex G-75 瑞典 Amersham pharmacia公司；其他常規試劑均為國產或進口分析純。

蛋白電泳槽 美國Bio-Rad公司；GR21G型落地式冷凍離心機 日本日立公司。

1.2 菌種與培養基

蛋白酶高產菌株由本實驗室分離篩選得到，經鑒定并命名為Bacillus licheniformis XG12。

培養基和培養條件：接種適量的B. licheniformis XG12菌懸液于產酶培養基(葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L、CaCl22g/L、MgSO4·7H2O 0.01g/L、KH2PO40.1g/L、K2HPO40.5g/L、酵母浸膏2g/L、NaCl 0.15g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L、MnSO4·4H2O 0.01g/L)中，pH10.0，40℃，200r/min培養48h。發酵培養物在4℃條件下8000r/min離心15min，去除細胞，上清液作為粗酶液進行下面的分離純化操作。

1.3 酶的分離純化

將發酵液離心取上清液，進行硫酸銨分級鹽析(40%～70%飽和度)，沉淀溶于20mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，對相同的緩沖液充分透析，12000r/min離心10min后，取2mL離心后的上清液上樣DEAESepharose fast flow (2.5cm×30cm)陰離子交換柱，用0～1.0mol/L的NaCl溶液(20mmol/L Tris-HCl，pH8.0)進行線性梯度洗脫，洗脫速度為0.6mL/min。測定各收集管洗脫液的酶活力。合并有活性的收集管，裝入透析袋，用聚乙二醇20000進行包埋，濃縮后取0.6mL樣品上樣Sephadex G-75 (1.6cm×90cm)分子篩凝膠柱，用0.02mol/L NaCl(溶于20mmol/L Tris-HCl，pH8.0)溶液進行洗脫，洗脫速度為0.4mL/min。收集有酶活性部分檢測酶純度及用于酶學性質的研究。

1.4 酶活性測定

參考Kembhavi等[8]的方法，并對其略有修改。取0.5mL待測酶液加入到1mL含有1g/100mL干酪素的20mmol/L的甘氨酸-NaOH緩沖溶液(pH10.0)中，40℃水浴保溫15min后，加入1mL 10g/100mL的三氯乙酸溶液終止反應，再將以上混合物置于室溫存放15min，12000r/min離心15min去除沉淀。上清液采用福林-酚試劑法測定蛋白質含量。標準曲線是以0～50mg/L的酪氨酸制作。空白對照為加入三氯乙酸溶液后再加入酶液，其他同上面一樣。蛋白酶活性的定義：1個單位的蛋白酶活性為在實驗條件下每分鐘干酪素釋放lμg酪氨酸所需的酶量。所有的測定都重復3次，取其平均值。

1.5 蛋白濃度測定

采用Lowry法[9]，以牛血清白蛋白制作標準曲線對蛋白濃度進行定量。

1.6 分子質量的測定

1.6.1 凝膠過濾

藍色葡聚糖上樣Sephadex G-75凝膠色譜柱，測定柱空隙體積(Vo)，然后上樣標準蛋白及樣品蛋白，測定各蛋白的洗脫體積(Ve)，以各標準蛋白的洗脫體積同柱空隙體積的比率(Ve/Vo)同標準蛋白的分子質量對數(lgMW)制作標準曲線。然后從標準曲線中求出該蛋白酶的表觀分子質量。標準蛋白為兔磷酸化酶B、牛血清白蛋白、兔肌動蛋白、胰蛋白酶抑制劑、雞蛋清溶菌酶作標準蛋白。

1.6.2 SDS-PAGE凝膠電脈

按Laemmli[10]的方法進行SDS-PAGE凝膠電脈，分離膠質量分數12%，濃縮膠質量分數5%。將樣品及標準蛋白(兔磷酸化酶B(97400D)、牛血清白蛋白(66200D)、兔肌動蛋白(43000D)、牛碳酸酐酶(31000D)、胰蛋白酶抑制劑(20100D)、雞蛋清溶菌酶(14400D))進行SDS-PAGE電泳，然后以相對遷移率對分子質量作圖，從圖中求出該蛋白酶的分子質量。

1.7 蛋白酶性質研究

1.7.1 溫度和pH值對酶活性的影響

蛋白酶最適溫度的測定在0.02mol/L的甘氨酸-NaOH緩沖溶液(pH10.0)中，不同溫度(10～90℃)條件下進行酶促反應。熱穩定性測定是將酶在不同溫度(40～80℃)條件下保溫120min，從開始每隔30min 取出一支試管，于冰水中冷卻后，按照1.4節方法測定殘余酶活力。以未經過熱保溫的酶液作為空白對照(100%)，計算相對酶活力。

純化后的蛋白酶在不同pH6.0～12.0條件下進行酶促反應以測定其最適pH值。測定pH值穩定性是將酶液加入到20mmol/L的不同pH值緩沖液中，再于40℃保溫1h，然后按照1.4節方法測定剩余蛋白酶的活力，計算相對酶活力。所用緩沖液為：pH6.0～7.5的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，pH8.0～8.5的Tris-HCl緩沖液，pH9.0～10.5的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，pH11.0～12.0的磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液。

1.7.2 金屬離子、抑制劑和表面活性劑對酶活力的影響

取適當稀釋的酶液，向其中分別加入用蒸餾水配制的金屬鹽溶液，使金屬離子終濃度達到5mmol/L，40℃保溫1h后，按1.4節方法測定殘余酶活力。

將各種不同的酶抑制劑與純化后的酶液混合達到一定終濃度，在40℃孵育1h后，按照按1.4節方法測定殘余相對酶活力。

為測定表面活性劑對酶穩定性的影響，將純化后的酶液同不同濃度不同表面活性劑、氧化劑在40℃孵育1h，再以1.4節方法測定殘余相對酶活力。以上均以不加金屬離子、表面活性劑、氧化劑及抑制劑的酶液作為空白對照(100%)。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的分離純化

發酵液離心分離菌體，上清液采用40%～70%飽和度硫酸銨分級鹽析后，得到的沉淀蛋白溶解在20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖溶液中。充分透析后，發酵液中大部分的黃褐色色素及部分雜蛋白被分離到透析液中，同時粗酶液深度濃縮。樣品上樣陰離子交換柱DEAESepharose FF，緩沖溶液充分洗脫，去除未結合的雜蛋白，A280nm在0.02以下時，改用NaCl線性梯度洗脫，洗脫曲線如圖1所示。

圖1 DEAE-Sepharose FF離子交換層析Fig.1 DEAE-Sepharose fast flow ion exchange chromatography of the protease

圖2 Sephadex G-75分子篩凝膠過濾層析Fig.2 Sephadex G-75 gel filtration chromatography of the protease

由圖1可知，洗脫得到一個大的主峰和3個小的蛋白峰。經檢測，大的主峰沒有酶活性，而第一個小峰檢測到強的蛋白酶活力。從蛋白洗脫曲線及收集管顏色判斷，樣品中大部分雜蛋白及殘余色素經該柱層析后，完全同酶蛋白分開。酶蛋白洗脫出的NaCl濃度約為0.4mol/L。合并含酶活力的收集管，濃縮后，上樣分子篩凝膠柱Sephadex G-75，洗脫得到4個小的蛋白峰。檢測到第3個蛋白峰含有較強酶活性(圖2)。經過以上純化步驟后，蛋白酶比活力達到1695.5U/mg，純化了42.6倍，回收率25.3%(表1)。

表1 地衣芽孢桿菌XG12蛋白酶的分離純化Table 1 Isolation and purification of the alkaline protease from B. licheniformis XG12

經過以上各步分離純化的酶液SDS-PAGE檢測，結果見圖3。最后分離純化后的酶液電泳顯示單一條帶，表明酶蛋白達到電泳純，同標準分子質量蛋白對照顯示，蛋白酶表觀分子質量約為29.5kD，與通過Sephadex G-75色譜柱測得的分子質量相一致。由此推斷，純化到的蛋白酶是單亞基蛋白。微生物來源的堿性蛋白酶分子質量一般在15～36kD。菌株XG12蛋白酶與報道的堿性蛋白酶相比較，比源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis PE-11)(15kD)[11]、庫特氏菌(Kurthia spiroforme sp.)(8kD)[12]的蛋白酶分子質量要大，但小于來自嗜鹽嗜堿芽孢桿菌(Bacillus sp.)(30～32kD)[7]的蛋白酶分子質量。

圖3 地衣芽孢桿菌XG12蛋白酶SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE of the fractions containing B. licheniformis XG12 protease obtained from successive purification steps

2.2 蛋白酶的酶學性質

2.2.1 蛋白酶最適作用溫度及熱穩定性

圖4 溫度對地衣芽孢桿菌XG12蛋白酶活性的影響Fig.4 Effect of temperature on B. licheniformis XG12 protease activity

如圖4所示，在溫度20～60℃范圍內，都具有較強活性，相對酶活力都在80%以上，而在60℃以上或20℃以下，所測酶活性較低。酶最適作用溫度為40℃，比所報道的大部分芽孢桿菌蛋白酶最適溫度都要低，如短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)(60℃)[13]、莫哈韋芽孢桿菌(Bacillus mojavensis)(60℃)[14]、嗜熱芽孢桿菌(thermophilic Bacillus sp. PS719)(75℃)[15]等。蛋白酶在較低的溫度下具有高活力，從節約能源角度考慮，具有重要意義。將蛋白酶添加到食品原料中，在降低溫度條件下，可以達到更好的水解效果。

圖5 溫度對地衣芽孢桿菌XG12蛋白酶穩定性的影響Fig.5 Effect of temperature on B. licheniformis XG12 protease stability

如圖5所示，此蛋白酶在40～60℃非常穩定，經過90min的孵育后，殘余相對酶活力都在80%以上。但在80℃條件下孵育30min，殘余酶活會大幅度降低。整體而言，同所報道的其他微生物如嗜鹽嗜堿芽孢桿菌(haloalkaliphilic Bacillus sp.)[7]、棒曲霉(Aspergillus clavatus ES1)[16]等蛋白酶比較，地衣芽孢桿菌XG12蛋白酶熱穩定性較好，在常規的食品加工時間內溫度即使上升到60℃蛋白酶活性也不會大幅下降。

2.2.2 蛋白酶的最適作用pH值及穩定性

純化后的蛋白酶在不同pH值的緩沖體系中，40℃條件下測定酶活性，結果如圖6所示，蛋白酶在pH7.5～11之間所測相對酶活力均在在70%以上，最適作用pH值與所報道的枯草芽孢桿菌蛋白最適pH值一致[11]，為pH10.0，具有典型的堿性蛋白酶特征[17-18]，故地衣芽孢桿菌XG12蛋白酶屬于堿性蛋白酶。而文獻所報道的如從蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus BG1)、綠膿桿菌PseA(Pseudomonas aeruginosa PseA)[19-20]等菌株來源的堿性蛋白酶最適pH值在8.0～9.0之間，當超過10.0時，活性幾乎完全喪失。

圖6 pH值對地衣芽孢桿菌XG12蛋白酶活性及穩定性的影響Fig.6 Effect of pH on B. licheniformis XG12 protease activity and stability

如圖6所示，酶的pH值穩定性曲線同活性曲線基本一致，在pH7.0～11.0之間保持85%以上的酶活性，而在pH7.0以下，酶活性則急速下降，表明蛋白酶在堿性環境下非常穩定。

2.2.3 金屬離子對酶活性的影響

從表2可見，Cu2+、Fe2+、Hg2+在所檢測范圍內可以抑制30%～60%的酶活性，Zn2+對酶的抑制活性較弱；Ba2+、Na+、K+對酶活性的影響不明顯；Mg2+、Ca2+、Mn2+對蛋白酶有較強的激活作用，Mg2+的激活作用最強，可以使酶活性提高30%以上，這與所報道的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis PE-11)堿性蛋白酶[11]相同。初步推測，Mg2+在酶的活性中心結構方面具有一定的功能。

2.2.4 蛋白酶抑制劑對酶活力的影響

純化的蛋白酶同不同種類的抑制劑孵育1h后，最適作用條件下檢測酶活力，結果如表3所示。半胱氨酸蛋白酶抑制劑如碘乙酸鹽(iodoacetate，0.05mmol/L)、E64(0.2mmol/L)、β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol，1mmol/L)、半胱氨酸(cysteine，5mmol/L)對酶活力基本沒有抑制作用；天冬氨酸蛋白酶抑制劑抑肽素(pepstatin，1mmol/L)對酶也沒有抑制作用。金屬酶抑制劑EDTA和EGTA基本沒有抑制作用。胰凝乳蛋白酶抑制劑(0.1mmol/L)幾乎可以完全抑制酶活性。大豆胰蛋白酶抑制劑(soybean trypsin inhibitor，0.05mmol/L)處理后仍有65%的酶活力殘存。而絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride，2mmol/L)、抑肽酶(aprotinin，0.5mmol/L)、彈性蛋白酶抑制劑(elastinal，0.2mmol/L)以及3,4-二氯異香豆素(3,4-dichloroisocoumarin，2mmol/L)完全抑制酶活力，表明該酶活性中心可能含有絲氨酸殘基，故該地衣芽孢桿菌XG12蛋白酶歸為絲氨酸蛋白酶。

表2 金屬離子對地衣芽孢桿菌XG12蛋白酶活性的影響Table 2 Effects of metal ions on B. licheniformis XG12 protease activity

表4 表面活性劑、氧化劑對酶活力的影響Table 4 Effect of surfactants and oxidants on B. licheniformis XG12 protease activity

表3 蛋白酶抑制劑對地衣芽孢桿菌XG12蛋白酶活力的影響Table 3 Effects of protease inhibitors on protease activity from B. licheniformis XG12

2.2.5 表面活性劑、氧化劑對酶活性的影響

表4顯示，非離子型表面活性劑Triton X-100、Tween-20及Tween-80對地衣芽孢桿菌XG12蛋白酶均沒有抑制作用，而Tween-20及Tween-80還具有較強的激活作用，Tween-20能使酶活力提高到124%。陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)對酶活性沒有影響。強陰離子表面活性劑SDS往往是很多酶的抑制劑，而0.1g/100mL的SDS能夠激活蛋白酶酶活性達113%。氧化劑雙氧水、過硼酸鈉、次氯酸鈉對酶活性有較低的影響，在40℃孵育1h，酶活性損失僅為20%～25%，表明該酶耐受氧化劑的能力很強。

3 結 論

目前，雖然有幾種來自芽孢桿菌屬的絲氨酸蛋白酶被分離純化，但地衣芽孢桿菌這個屬的胞外堿性絲氨酸蛋白酶還未見報道，本實驗采取硫酸銨分級鹽析、DEAE-Sepharose陰離子交換層析和Sephadex G-75分子篩凝膠過濾層析的方法，純化到了電泳純的蛋白酶。

已報道的絲氨酸蛋白酶活性和穩定性對環境條件的要求比較嚴格，有的堿性蛋白酶即使在較短的時間內也很快失去了活性。本實驗從地衣芽孢桿菌XG12中分離并純化了胞外堿性絲氨酸蛋白酶，該酶也與其他的堿性絲氨酸蛋白酶相似，分子質量29.5kD，最適反應溫度為40℃。酶學性質研究表明，地衣芽孢桿菌XG12堿性絲氨酸蛋白酶不僅在較低的溫度下具有高活性，而且在較廣的堿性條件下和較高的溫度下都能維持高活性并十分穩定，而且高濃度的表面活性劑、氧化劑都對酶活性沒有多大影響，甚至能促進酶活性。實驗表明該酶在60℃維持90min酶活還在80%以上；在pH7.0～11.0之間孵育1h，測得酶活性高于85%。不同種類的洗滌劑處理1h，酶活性都保持在100%以上，而Tween-20及Tween-80對酶還有強烈的激活作用。相對來說，它是一種很穩定的堿性絲氨酸蛋白酶。這些優良特性使蛋白酶在食品等領域有著潛在應用價值。

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Purification and Characterization of Surfactant-stable Protease

GAO Zhao-jian，LI Chao，HOU Jin-hui
(College of Food (Biological) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

A surfactant-stable alkaline protease was isolated and purified from Bacillus licheniformis XG12, and its enzymatic properties were also characterized. A protease with high purity from strain XG12 was purified by precipitation with ammonium sulfate, DEAE-Sepharose ion exchange chromatography and Sephadex G-75 gel filtration chromatography. The purified protease exhibited a 42.6-fold enhancement in specific activity and its recovery rate was 25.3%. The enzyme was composed of a single polypeptide chain with an apparent molecular mass of 29.5 kD as determined by SDS-PAGE. This alkaline protease was highly active and stable in the pH range of 7.0－11.0 with an optimal pH of 10.0. The maximum activity of this alkaline protease was observed at 40 ℃. In addition, this protease could be activated by divalent cations such as Mg2+, Ca2+and Mn2+and inhibited by serine-protease inhibitors, suggesting that this alkaline protease was a serine-protease. Moreover, this alkaline protease also exhibited extreme stability towards anionic (0.1% SDS), cationic (0.1% CTAB), non-ionic surfactants (1% Tween-80, 1%Tween-20 and 1% Triton X-100) and oxidants. Due to its promising properties, this alkaline protease from Bacillus licheniformis XG12 will have potential applications in food and laundry detergents.

Bacillus licheniformis XG12；protease；purification；surfactant；characterization

Q814.1

A

1002-6630(2011)05-0211-06

2010-06-24

徐州工程學院青年培育基金項目(XKY2009123)

高兆建(1976—)，男，講師，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：gaozhaojian@126.com