SHIV1157ipd3N4中國恒河猴細胞適應(yīng)株靜脈感染中國恒河猴有效濃度的確定

叢 喆，蔣 虹，金 光，陳 霆，王 衛(wèi)，陶 真，姚 南，熊 競，吳芳新，陳志偉，魏 強

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021;2.香港大學(xué)李嘉誠醫(yī)學(xué)院艾滋病研究所，香港 999077)

SHIV1157ipd3N4中國恒河猴細胞適應(yīng)株靜脈感染中國恒河猴有效濃度的確定

叢 喆1，蔣 虹1，金 光1，陳 霆1，王 衛(wèi)1，陶 真1，姚 南1，熊 競1，吳芳新1，陳志偉2，魏 強1

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021;2.香港大學(xué)李嘉誠醫(yī)學(xué)院艾滋病研究所，香港 999077)

目的 確定SHIV1157ipd3N4靜脈途徑感染中國恒河猴的有效病毒濃度，明確SHIV1157ipd3N4感染實驗猴體內(nèi)病毒復(fù)制和免疫損傷情況。方法 10只正常中國恒河猴分成6組，分別用10倍系列稀釋的病毒液1 mL靜脈感染，測定血漿病毒載量，CD4+/CD8+，CD4+T淋巴細胞絕對數(shù)，分析感染后恒河猴體內(nèi)病毒復(fù)制和免疫損傷情況。結(jié)果 5TCID50/mL以上濃度的SHIV1157ipd3N4能通過靜脈途徑感染中國恒河猴。結(jié)論 該實驗的成功進行為SHIV/中國恒河猴疾病及評價模型的建立奠定了良好的基礎(chǔ)，為今后使用此模型評價抗病毒藥物或疫苗提供了條件。

SHIV1157ipd3N4;中國恒河猴;模型，動物;AIDS

R.M.Ruprecht以SHIVKB9為骨架構(gòu)建了表達HIV-1 C亞型 env的 SHIV-1157i，并經(jīng)靜脈途徑感染印度恒河猴得到 SHIV1157ipd3N4［1，2］。它所具有高度復(fù)制能力的、CCR5受體嗜性、經(jīng)黏膜傳播這些特性，使它在研究HIV感染和發(fā)病機制及評價AIDS候選疫苗的功效方面具有重要的現(xiàn)實意義。SHIV1157ipd3N4能通過靜脈途徑成功感染印度恒河猴，黏膜途徑感染印度恒河猴、豬尾猴和中國恒河猴［3-4］，但其靜脈感染中國恒河猴的有效濃度、疾病進程及所引發(fā)的病毒免疫指標(biāo)有哪些變化，與黏膜途徑感染引起的變化又是否相同呢?本研究旨在明確SHIV1157ipd3N4在中國恒河猴體內(nèi)感染的有效濃度及在病毒學(xué)和免疫學(xué)等方面的變化，為今后此模型在我國的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

中國恒河猴10只，購自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所［SCXK(京)2005-2005］，用商品化膨化飼料飼養(yǎng)，體重3～5 kg。經(jīng)間接免疫熒光法(IFA)檢測排除相關(guān)慢病毒(SIV、SRV-1，2，5、STLV-1)感染。

1.2 病毒

感染毒株為SHIV1157ipd3N4，本實驗室擴增制備，批號為 20090706。中國恒河猴 PBMCs滴定TCID50滴度為 5×102TCID50/mL。

1.3 分組設(shè)計及感染方法

10只恒河猴隨機分為6個劑量組，由10-1至10-6，分別經(jīng)后肢靜脈感染稀釋好的病毒液1 mL。G1005V、G1006V、G1007V (10-1，50TCID50)，G1008V、G1009V 、G1010V(10-2，5TCID50)，G1011V、G1012V、G1013V(10-3，0.5TCID50)，G1014V(10-4，0.05TCID50)。

1.4 樣品采集和指標(biāo)測定

在感染前和感染后 7、14、21、28、42、56、70 及84 d采集EDTA抗凝血4 mL，分別測定血常規(guī)、血漿病毒載量、CD4+/CD8+、CD4+細胞絕對數(shù)和血漿結(jié)合抗體水平。

1.5 SHIV1157ipd3N4感染恒河猴外周血病毒載量的檢測

TRIzol法提取血漿中病毒 RNA，Quantitect SYBR Green RT-PCR Kit(Qiagen，204243)測定血漿病毒 RNA 載量［5］。

1.6 SHIV1157ipd3N4感染恒河猴CD4+T細胞絕對數(shù)檢測

測定外周血中 CD4+/CD8+比值，根據(jù)血常規(guī)結(jié)果，計算出CD4+T細胞絕對數(shù)［6］。

1.7 SHIV1157ipd3N4感染恒河猴外周血總結(jié)合抗體滴度檢測

恒河猴血漿樣品滅活后系列稀釋，用“人類免疫缺陷病毒抗體診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)”(生物梅里埃，A4 4284018-86)檢測交叉性體液免疫反應(yīng)，高于Cut-off值的最大血漿稀釋度定義為SHIV特異性總結(jié)合抗體滴度［7］。

圖1 10倍系列稀釋SHIV1157ipd3N4靜脈感染中國恒河猴外周血病毒載量結(jié)果Fig.1 The viremia(viral RNA copies/mL plasma)in the Chinese-origin rhesus macaques infected intravenously with 10-fold dilution of SHIV1157ipd3N4

2 結(jié)果

2.1 SHIV1157ipd3N4靜脈感染恒河猴外周血病毒載量結(jié)果

50 TCID50感染猴中G1005V和G1007V均在感染后7 d就檢出血漿病毒載量，G1006V也在14 d陽轉(zhuǎn)。5 TCID50感染猴 G1008V、G1009V、G1010V 的血漿病毒載量則均出現(xiàn)在感染后14 d。

6只感染猴高峰期的載量都在105～107copies/mL之間，42 d后載量水平均有所下降，但隨后反彈。0.5 TCID50和 0.05 TCID50感染猴 G1011V、G1012V、G1013V、G1014V在實驗期間未出現(xiàn)血漿病毒載量。

2.2 SHIV1157ipd3N4靜脈感染恒河猴CD4+/CD8+比值結(jié)果

50 TCID50感染猴 G1005V、G1006V、G1007V 在感染后21 d均有下降，隨后反彈。5 TCID50感染猴中除G1010V外，G1008V和G1010V也在21 d下降并反彈。G1009V則不降反升，但它在56 d有一次大幅下降，但也仍然在 1以上。0.5TCID50和0.05TCID50感 染 猴 G1011V、G1012V、G1013V、G1014V在實驗期間基本保持恒定(圖2)。

2.3 SHIV1157ipd3N4靜脈感染恒河猴CD4+細胞絕對數(shù)結(jié)果

各劑量組之間在CD4+T細胞絕對數(shù)上變化基本相同。感染猴中除了50 TCID50感染猴 G1007V和5 TCID50感染猴 G1008V在實驗后期有升高外，其它4只在整個實驗期間基本保持水平。未感染的4只實驗猴則整體呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(圖3)。

2.4 SHIV1157ipd3N4靜脈感染恒河猴外周血總結(jié)合抗體滴度測定

50 TCID50感染猴G1005V和G1007V的抗體在感染后21 d就出現(xiàn)了，另一只感染猴G1006V也在28 d陽轉(zhuǎn)。與此同時，5 TCID50感染猴中只有G1009V在21 d抗體陽性，其它兩只感染猴G1008V和G1010V抗體陽轉(zhuǎn)時間為42 d。42 d以后，6只感染猴之間的抗體水平逐漸接近了。0.5 TCID50和0.05 TCID50感 染 猴 G1011V、G1012V、G1013V、G1014V在實驗期間未檢出抗體(圖4)。

圖2 10倍系列稀釋SHIV1157ipd3N4靜脈感染中國恒河猴外周血CD4+/CD8+T淋巴細胞比值Fig.2 The changes of CD4+/CD8+ratio of T lymphocytes in the Chinese-origin rhesus macaques infected intravenously with 10-fold dilution of SHIV1157ipd3N4

圖3 10倍系列稀釋SHIV1157ipd3N4靜脈感染中國恒河猴外周血CD4+T淋巴細胞絕對數(shù)Fig.3 The CD4+T cell counts(per l blood)in the Chinese-origin rhesus macaques infected intravenously with 10-fold dilution of SHIV1157ipd3N4

圖4 10倍系列稀釋SHIV1157ipd3N4靜脈感染中國恒河猴外周血總結(jié)合抗體滴度Fig.4 The titers of Ab in the Chinese-origin rhesus macaques infected intravenously with 10-fold dilution of SHIV1157ipd3N4

3 討論

SHIV1157ipd3N4。具有高度復(fù)制能力、CCR5受體嗜性和經(jīng)黏膜傳播的特性，使它在研究HIV感染和發(fā)病機制及評價AIDS候選疫苗的功效方面具有重要的現(xiàn)實意義。

本實驗室利用中國恒河猴PBMCs制備了一批SHIV1157ipd3N4的細胞適應(yīng)株，本研究旨在明確該批次SHIV1157ipd3N4細胞適應(yīng)株靜脈途徑感染中國恒河猴的有效濃度及在病毒學(xué)和免疫學(xué)等方面的變化，為今后此模型在我國的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

本次研究中，我們使用中國恒河猴PBMCs對病毒的毒力進行了滴定。根據(jù)滴定的結(jié)果，使用4個10倍系列稀釋的病毒劑量感染中國恒河猴，通過其血漿病毒載量、CD4+/CD8+比值及CD4+細胞絕對數(shù)的測定，來確定該病毒感染中國恒河猴的感染劑量范圍及感染情況。由于動物數(shù)量有限，為了明確劑量效應(yīng)關(guān)系，我們采取了10倍系列稀釋病毒的策略，拉大了各組之間的病毒劑量范圍。并且對可能感染的實驗組，各使用了3只實驗猴，理論上不能被感染的10-4稀釋度，只用了一只實驗猴。結(jié)果證明，我們這樣安排是可行的。10-1到 10-2的感染猴，即 50 TCID50到 5 TCID50SHIV1157ipd3N4感染的實驗猴均成功建立了系統(tǒng)性感染，而10-3和10-4的感染猴則沒有被感染。根據(jù)病毒滴定的結(jié)果，1 mL 10-3和10-4稀釋度的病毒液中只含有 0.5 TCID50和0.05 TCID50的病毒，理論上不可能感染動物，因此目前這個結(jié)果和病毒滴定的結(jié)果是相符合的，從另一個側(cè)面也證明了病毒滴定的準(zhǔn)確性。

與SHIVSF162p3靜脈感染猴結(jié)果略有不同，各不同劑量組陽性猴的病毒、免疫等各項指標(biāo)沒有顯示出很明顯的量效關(guān)系，除高劑量組(50 TCID50)的血漿病毒載量出現(xiàn)得比低劑量組(5 TCID50)略早幾天外，載量的峰值及持續(xù)時間都沒有依照病毒濃度的高低，有相應(yīng)的變化。各組感染猴高峰期的載量都在105～107copies/mL之間，CD4+/CD8+的變化也基本相同。與未感染猴不同的是，絕大多數(shù)感染猴在感染高峰期還是有一個CD4+/CD8+的下降，雖然過程很短暫，與此同時，各組之間外周血CD4+T細胞的絕對數(shù)的變化趨勢相同，均沒有明顯的下降。這點也符合之前的報道，對于 CCR5-SHIV來說，CD4+T細胞的減少主要發(fā)生在外周免疫器官，如腸道的派氏淋巴結(jié)等，而在外周血中這種變化不明顯。

本研究中，我們還注意了靜脈感染早期外周血中總結(jié)合抗體滴度的變化和攻毒劑量之間的關(guān)系。結(jié)果表明，高劑量組(50 TCID50)的抗體出現(xiàn)得比低劑量組(5 TCID50)略早幾天，且抗體水平增長得要快一些，但到了感染后期這種差距就消失了，基本都穩(wěn)定在一個水平上了。這也說明，在感染早期，機體體液免疫的水平和消長與攻擊病毒的劑量有一定的關(guān)系，一旦建立了系統(tǒng)性感染，這種區(qū)別就不存在了。

SHIV1157ipd3N4能通過靜脈途徑成功感染印度恒河猴，黏膜途徑感染印度恒河猴、豬尾猴和中國恒河猴，但其靜脈感染中國恒河猴的有效濃度、疾病進程及所引發(fā)的病毒免疫指標(biāo)有哪些變化，與黏膜途徑感染引起的變化又是否相同呢?本研究旨在明確SHIV1157ipd3N4在中國恒河猴體內(nèi)感染的有效濃度及在病毒學(xué)和免疫學(xué)等方面的變化，為今后此模型在我國的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

總之，通過本次靜脈感染中國恒河猴研究，我們成功滴定了本批次 SHIV1157ipd3N4，掌握了SHIV1157ipd3N4在恒河猴體內(nèi)的消長規(guī)律，今后可根據(jù)具體的實驗?zāi)康倪x擇合適劑量的SHIV1157ipd3N4建立靜脈感染模型，進行 AIDS疫苗評價。

［1］ Song RJ，Chenine AL，Rasmussen RA，et al.Molecularly Cloned SHIV-1157ipd3N4： a highly replication competent，mucosally transmissible R5 simian-human immunodeficiency virus encoding HIV Clade C env［J］.J Virol，2006，80(17)：8729-8738.

［2］ Humbert M，Rasmussen RA，Song RJ，et al.SHIV-1157i and passaged progeny viruses encoding R5 HIV-1 clade C env cause AIDS in rhesus monkeys［J］.Retrovirology，2008，5： 94.Published online 2008 October 17.doi：10.1186/1742-4690-5-94.

［3］ Ho O，Larsen K，Polacino P，et al.Pathogenic infection of Macaca nemestrina with a CCR5-tropic subtype-C simian-human immunodeficiency virus［J］.Retrovirology，2009，6：65.

［4］ Chenine AL， SiddappaNB， KramerVG， etal.Relative transmissibility of an R5 clade C simian-human immunodeficiency virus across different mucosae in macaques parallels the relative risks of sexual HIV-1 transmission in humans via different routes［J］.J Infect Dis，2010，201(8)：1155-1163.

［5］ 叢喆，李兆忠，魏強，等.SYBR GreenⅠ實時熒光定量RTPCR測定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷貝數(shù)方法的建立［J］.中國實驗動物學(xué)報，2006，14(4)：271-275.

［6］ 王衛(wèi)，劉強，許琰，等.SHIV-KB9感染中國恒河猴有效濃度的確定［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2007，17(2)：67-71.

［7］ 張月娟，褚國方.ELISA檢測HIV抗體室內(nèi)質(zhì)控血漿的使用與分析［J］.職業(yè)與健康，2007，23(4)：268-269.

Titration of a SHIV1157ipd3N4 Stock by Intravenous Inoculation of Chinese-Origin Rhesus Macaques

CONG Zhe1，JIANG Hong1，JIN Guang1，CHEN Ting1，WANG Wei1，TAO Zhen1，YAO Nan1，XIONG Jing1，WU Fang-xin1，CHEN Zhi-wei2，WEI Qiang1
(1.Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Disease Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China;2.AIDS Institute，Li Ka Shing Faculty of Medicine，The University of Hong Kong，Hong Kong 999077，China)

Objective To determine the viral concentration of SHIV1157ipd3N4 to infect Chinese-origin rhesus macaques intravenously，and to clarify the viral replication and immunological impairment in the monkeys after SHIV1157ipd3N4 inoculation.Methods 10 Chinese-origin rhesus macaques were used in this study.Firstly，all the monkeys were screened by serological test to ensure that they were free of SIV，SRV，and STLV.Then they were infected with 1 mL of 10-fold serial dilution of SHIV1157ipd3N4 separately.Finally to make blood routine examination and measure the viral loads of the monkeys by real-time RT-PCR.Results More than 5 TCID50/mL of SHIV1157ipd3N4 can infect the Chinese-origin rhesus macaques i.v.successfully.Conclusions Our findings of this study provide a firm basis for establishing a SHIV1157ipd3N4 infection model of Chinese rhesus macaques intravenously.This model would be very usefulfor HIV-1 subtype C vaccine and pathogenesis studies.

SHIV1157ipd3N4;Chinese-origin rhesus macaques;Animal model;AIDS

R33

A

1671-7856(2011)04-0012-04

2010-10-08

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.04.003

國家十一五科技重大專項課題 (2009ZX10004-402，2008ZX10001-015-10)。

叢喆，碩士，副主任技師，從事實驗動物病毒分子生物學(xué)和模型研究工作。

魏強，教授，博士導(dǎo)師，研究方向：實驗動物病毒學(xué)。E-mail：weiqiang0430@sohu.com。