固定化HRP/H2O2/ACAC酶促體系引發下降解淀粉接枝丙烯酰胺共聚物的合成與表征

閆小亮，呂生華，侯明明，弓 瑞

（陜西科技大學資源與環境學院，陜西 西安 710021）

研究開發

固定化HRP/H2O2/ACAC酶促體系引發下降解淀粉接枝丙烯酰胺共聚物的合成與表征

閆小亮，呂生華，侯明明，弓 瑞

（陜西科技大學資源與環境學院，陜西 西安 710021）

以殼聚糖為載體、戊二醛為交聯劑制備固定化辣根過氧化物酶（HRP），采用固定化 HRP/H2O2/乙酰丙酮（ACAC）酶促體系制備降解淀粉-丙烯酰胺接枝共聚物（St-g-PAM），通過紅外光譜、紫外光譜、核磁共振和電鏡掃描等手段對接枝共聚產物進行了結構分析。結果表明，丙烯酰胺成功接枝在降解淀粉上。共聚物用做皮革復鞣劑進行了應用實驗，應用結果表明復鞣后的革柔軟、纖維分散好和選擇填充性強。

固定化辣根過氧化物酶；酶促聚合；接枝共聚；鞣劑

淀粉接枝丙烯酰胺共聚物是聚丙烯酰胺（PAM）具有重要價值的改性產品，它不僅具有聚丙烯酰胺的良好性能，而且降低了原料成本，改善了其適應介質的能力，提高了儲存穩定性和熱穩定性，擴展了應用領域，在廢水處理、石油開采等領域有著廣泛的應用。目前對淀粉接枝丙烯酰胺共聚物的研究在水溶液聚合中主要是采用硝酸鈰銨、過硫酸鹽、高錳酸鉀和雙氧水等作為引發劑，但這些方法都有一些缺點，例如鈰鹽作為引發劑，反應工藝條件控制要求嚴，價格昂貴；過硫酸銨、H2O2作為引發劑，均聚物多，接枝效率低；高錳酸鉀作為引發劑，需嚴格控制酸的濃度，避免淀粉的酸水解，使用時還需注意接枝淀粉的顏色變化[1-2]。近些年，辣根過氧化物酶（HRP）與 H2O2和β-二酮組成的酶促體系可引發乙烯基單體的自由基聚合，成為當今生物催化聚合的研究熱點之一[3]。酶催化聚合反應具有反應溫和、活性可控、高效、綠色等優點，將其應用到淀粉的改性具有廣闊的開發前景，且符合綠色化學的發展方向，對于淀粉基接枝共聚物的進一步發展和應用具有重要意義[4]。但直接使用HRP引發體系的缺點是HRP無法重復使用，價格高，生產成本大，因此限制了HRP在工業化生產中的應用。酶的固定化技術可以提高酶的利用效率，在保持酶引發的高效、專一及溫和等特性的同時，使酶可以回收、多次重復使用，降低生產成本，有助于實現生產工藝和檢驗操作的連續化和工業化。固定化酶載體的選擇是關鍵，其中殼聚糖具有原料易得，價格低廉，力學性能良好，化學性能穩定等優點，近年來成為研究熱門的固定化材料之一[5-9]。

本研究對原淀粉進行酶降解，降低其聚合度，增加其水溶性和滲透性；然后在固定化HRP/H2O2/ACAC體系下制備降解淀粉-丙烯酰胺接枝共聚物，并對接枝共聚物進行表征。

1 實驗部分

1.1 主要試劑

辣根過氧化物酶（HRP），酶活力330 U/mg，上海雪滿生物科技有限公司；耐高溫α-淀粉酶，酶活力10 000 U/mL，山東安克生物工程有限公司；玉米淀粉，西安淀粉廠；30%過氧化氫、丙烯酰胺、乙酰丙酮、無水乙醇、殼聚糖、戊二醛、碳酸氫鈉、鹽酸，AR，西安三浦精細化工廠。

1.2 實驗步驟

1.2.1 殼聚糖固定化HRP

稱取1.0 g殼聚糖溶于質量濃度為l%冰乙酸中，加入2 mol/L NaOH水溶液，使其產生白色絮狀沉淀，水洗至中性，抽濾制成純化殼聚糖。將 0.5 g殼聚糖加到10 mL質量分數為25%的戊二醛溶液中，在25 ℃水浴搖床上振蕩6 h，洗去多余的戊二醛，抽濾，加入pH值為6.9的混合磷酸鹽緩沖液調節好的20 mL濃度為0.5 mg/mL的HRP溶液，在35 ℃水浴搖床上振蕩8 h，于冰箱中（4 ℃）靜置過夜，用上述混合磷酸鹽緩沖液洗滌，抽濾，直到濾液中檢測不到HRP，制得固定化HRP[10-12]。

1.2.2 降解淀粉的制備

在250 mL三口燒瓶中加入36 g淀粉、204 g去離子水和0.03 g耐高溫α-淀粉酶，在95 ℃反應1.5 h，然后在106 ℃滅活10 min，最終制得質量分數為15%的酶降解淀粉[13]。

1.2.3 淀粉接枝共聚物的制備

在150 mL三口燒瓶中加入50 g上述降解淀粉和6.6 g丙烯酰胺，用碳酸氫鈉調節反應體系的pH值為8，通氮氣15 min以除去溶液中的溶解氧，加入1.2 g乙酰丙酮和0.3 g殼聚糖固定化HRP，滴加4.7 mL質量分數為30%的H2O2，控制滴加時間為1 h，然后在35 ℃下反應4 h[14-17]。

反應結束后，將產物用乙醇洗滌，離心分離，在 50 ℃下真空干燥，得到去除單體的粗產物質量W1。粗產物用乙二醇/冰乙酸（體積比 60∶40）的混合液在索式萃取器中萃取8 h，去除均聚物得純產品質量W2。采用式（1）和式（2）計算反應的接枝率（GP）和接枝效率（GE）[18-19]：

式中，W1為去除單體的粗產物質量；W2為純接枝共聚物的質量；W0為淀粉的質量。

1.3 分析檢測

1.3.1 酶的負載率測定

測定HRP溶液在402 nm處的吸光度值，本實驗條件下酶的負載率按式（3）計算。

式中，A1、A2為固定化前、后 HRP溶液的紫外吸收值。

1.3.2 固定化酶比活力測定

在pH值為6.0的緩沖溶液中，以聯苯三酚為底物，分別以游離酶和固定化酶作為催化劑，用H2O2引發反應，5 min后用UV分光光度計測定在430 nm（催化產物紅培酚的特征峰）處的吸收值，按式（4）計算固定化酶的比活力。

式中，AF、AS為游離酶和固定化酶為催化劑時的吸收值。

1.3.3 結構表征

用EQUINOX-55傅里葉變換紅外光譜儀測定產物的紅外吸收光譜，用 UV1900雙光束紫外分光光度計測定產物紫外吸收光譜，用INOVA-400MHz超導核磁共振儀分別測定產物的1H NMR和13C NMR譜圖，用TM-1000 Tabletop型SEM觀察樣品的微觀結構。

1.3.4 皮革性能測試

利用MSW-YD4型數字式皮革收縮溫度測定儀測定復鞣革前后的收縮溫度（Ts）。使用拉力機（TS2000-S型）對復鞣后成品革進行力學性能檢測，主要測定抗張強度、撕裂強度和斷裂伸長率。

1.3.5 皮革厚度測量

從背脊線到腹部選定A、B、C 3處，每處測3次或者3次以上，取其平均值作為該處的厚度。采用式（5）計算皮革的增厚率（E）。

式中，d2為復鞣后皮革厚度，mm；d1為復鞣前皮革厚度，mm。

1.4 鞣劑應用工藝

所得合成產物進行復鞣實驗，實驗方法按照文獻[17]介紹進行。

2 結果與討論

2.1 酶的負載率、比活力及儲存穩定性

HRP溶液的紫外特征吸收波長為402 nm，測得402 nm處0.5 mg/mL的HRP溶液的吸收值為0.96；固定化酶后，剩余酶溶液的吸收值降低為0.40。根據式（3）計算得到酶的負載率為58.3%。經固定化酶催化后，測定反應液在 430 nm處的吸收值為0.39，用游離酶催化的吸收值為0.56，根據式（4）計算固定化酶的比活力為69.6%。將固定化HRP置于冰箱中存放20天后，結果顯示依然能有效催化降解淀粉與AM進行接枝共聚合反應，表明酶的儲存穩定性較好。

2.2 降解淀粉與丙烯酰胺接枝共聚物結構表征

2.2.1 FTIR分析

圖1為St-g-PAM、PAM和酶降解淀粉的FTIR譜圖。由圖可知，酶降解淀粉（曲線c）在3420 cm－1和2925 cm－1處的吸收峰分別是淀粉分子—OH和亞甲基伸縮振動吸收峰，在1026 cm－1處為淀粉結構單元葡萄糖環的特征吸收峰。聚丙烯酰胺（曲線b）在3438 cm－1、2925 cm－1和1645cm－1處分別為胺基、亞甲基和酰胺基團中羰基的伸縮振動吸收峰。在St-g-PAM（曲線a）中，不僅1157～1074cm－1出現淀粉的特征吸收峰和1026 cm－1處的葡萄糖環特征峰，而且在3431cm－1出現—OH的伸縮振動與—NH2的伸縮振動吸收疊加峰，在 1667 cm－1出現酰胺上C=O的伸縮振動峰，在1621 cm－1處出現C—N伸縮振動和N—H變角振動的偶合吸收峰。以上表明酶降解淀粉分子鏈上已接枝上PAM。

圖1 樣品的FTIR光譜圖

2.2.2 UV分析

圖2為St-g-PAM、PAM和酶降解淀粉的UV譜圖。由圖可知，酶降解淀粉在200～300 nm波長沒有吸收峰，說明淀粉在降解過程中葡萄糖單元上的羥基沒有被氧化成羧基。PAM的紫外光譜特征是在遠紫外光區 100～200nm波長有一個由 π→π*躍遷產生的吸收帶（最大吸收波長為193 nm），而酶降解淀粉通過與丙烯酰胺接枝反應后形成的St-g-PAM最大吸收峰波長為190 nm，發生藍移效應，吸收峰的波長向短波方向移動，以上也表明了酶降解淀粉分子鏈上已接枝上PAM。

2.2.3 NMR分析

圖2 樣品的UV光譜圖

圖3 酶降解淀粉和St-g-PAM的1H NMR圖譜

圖3為St-g-PAM和酶降解淀粉的1H NMR核磁共振波譜圖，圖3（b）中Ha，t、Hb，t、Hc，t代表接枝上的聚丙烯酰胺的—CH、—CH2和NH2上的氫位置。結果表明，酶降解淀粉顯現出淀粉葡萄糖單位α-1,4苷鍵相連H1（1-4）、α-1,6苷鍵相連H1（1-6）、H2、H3、H4、H5、淀粉糖環的異頭碳上的 H-γ、還原性末端為α（β）-異頭碳上的H-α和H-β的特征質子共振峰（δ=5.01，4.92，3.39，3.37，3.23，3.64，6.31，4.57和5.60）。St-g-PAM除出現淀粉的特征吸收峰，還顯現出聚丙烯酰胺的—CH、—CH2和NH2特征質子共振峰（δ=1.75、1.42和7.55）。

圖4為St-g-PAM和酶降解淀粉的13C NMR核磁共振波譜圖，圖4（b）中Ca，t、Cb，t、Cc，t代表接枝上的聚丙烯酰胺的—CH、—CH2和C=O上的碳位置。結果表明，酶降解淀粉顯現出淀粉葡萄糖單位上C1、C2、C3、C4、C5和C6共振峰（δ= 101.1、73.7、77.7、80.6、71.9和63.2）。St-g-PAM除出現淀粉的特征吸收峰，還顯現出聚丙烯酰胺—CH、—CH2和C=O的13C原子的共振峰（δ= 126.1、132.4和166.8）。因此，在本文的反應體系中，確實有St-g-PAM生成。

圖4 酶降解淀粉和St-g-PAM的13C NMR圖譜

2.2.4 SEM分析

圖5是玉米淀粉、酶降解淀粉和St-g-PAM的形態掃描電鏡照片。比較反應前后圖片的變化可以看出，原淀粉顆粒表面光滑，結構緊密，無裂縫，呈球形顆粒結構；當玉米淀粉經過酶催化水解后，淀粉顆粒破裂成碎片；而接枝反應后不僅顆粒表面發生了變化，表現為顆粒表面粗糙且有一些空隙，而且聚丙烯酸的支鏈分子已滲透到淀粉顆粒的內部，兩者相互滲透和結合，顆粒有些扭曲形變。

2.3 接枝反應機理的探討

在HRP/H2O2/ACAC三元體系催化下，淀粉與AM共聚反應過程如圖6所示：首先H2O2分子在HRP分子作用下發生異裂，然后在酶活性位點發生雙電子氧化過程，生成一個π-陽離子自由基HRP-I，并有水生成；接著HRP-I和enol（乙酰丙酮的烯醇互變異構）進行單電子氧化還原反應，得到化合物HRP-II和一個π-陽離子自由基，接著π-陽離子自由基脫質子得到一個初級自由基，HRP-II再通過類似的單電子氧化還原反應回復到初始態。初級自由基奪取淀粉葡萄糖單元上 C6羥基上的活潑氫后形成淀粉大自由基，與丙烯酰胺發生接枝聚合反應[20-23]。

圖5 玉米淀粉、酶降解淀粉和St-g-AM的電鏡掃描圖

圖6 淀粉接枝AM反應示意圖

2.4 應用實驗結果分析

選取制備的 St-g-PAM（GE和GP分別為86.3%、79.5%）進行2次平行應用試驗，結果見表 1。從應用結果可以看出：應用革樣收縮溫度（Ts）增加，說明St-g-PAM有一定的鞣性，能夠與皮膠原發生多點結合形成網絡結構，使皮膠原結構改變，從而提高坯革的耐濕熱穩定性；應用革樣增厚率沿A、B、C方向遞增，說明St-g-PAM有較好的填充作用，易與纖維發生交聯作用，撐開纖維束，起到增厚作用。從成革感觀性能來看，應用革樣均勻度好，柔軟性好。應用革樣的力學性能檢測結果如表2所示，可以看出St-g-PAM用于復鞣對皮革有增強作用，與皮革纖維有較好的結合。皮革斷面層的SEM如圖7所示，觀察應用革的電鏡照片可以說明皮革纖維的分散狀況。可以看出，未復鞣皮革纖維編織緊密，其切面纖維束的結構完整，經過St-g-PAM復鞣后的皮革纖維分散狀態比較好，說明St-g-PAM與皮革纖維進行了結合。

3 結 論

殼聚糖固定化HRP/H2O2/ACAC體系可以引發降解淀粉與丙烯酰胺發生接枝共聚物反應。由FTIR、UV和NMR證明生成了St-g-PAM，由SEM表征了淀粉反應前后微觀形貌的變化。該共聚物復鞣后的革柔軟、纖維分散好、選擇填充性強。

表1 復鞣劑應用結果

表2 成革各項力學性能

圖7 皮革斷面層的電鏡照片

[1]尚小琴，劉汝鋒，梁敏華，等．淀粉反相乳液法三元接枝共聚改性研究與表征[J]．化工進展，2010，29（8）：1517-1520．

[2]張斌，周永元．淀粉接枝共聚反應中引發劑的研究狀況與進展[J]．高分子材料科學與工程，2007，23（2）：36-39．

[3]蔡智奇，孫建中，周其云，等．辣根過氧化物酶酶促體系引發丙烯酰胺聚合的研究[J]．功能高分子學報，2004，17（1）：81-86．

[4]齊耿耿，孫建中，周其云，等．酶催化聚合研究進展[J]．功能高分子學報，2002，15（3）：347-352．

[5]吳劍剛，孫建中，周其云．固定化 HRP海藻酸鈣/殼聚糖微球催化水溶性導電聚苯胺的合成與表征[J]．華東理工大學學報，2006，32（6）：695-697．

[6]朱啟忠．殼聚糖固定化半纖維素酶的研究[J]．生物化學與生物物理進展，2000，27（3）：275-276．

[7]孫建華，戴榮繼，鄧玉林．酶固定化技術研究進展[J]．化工進展，2010，29（4）：715-721．

[8]左鵬，于少明，楊杰茄，等．辣根過氧化物酶固定化載體材料的研究進展[J]．材料導報，2007，21（11）：46-49．

[9]陳巍，羅志剛，李忠彥，等．天然多糖在酶固定化載體材料中的應用[J]．中國調味品，2006（2）：4-8．

[10]姜德生，龍勝亞，肖海燕，等．磁性殼聚糖微球的制備及其用作漆酶固定化載體[J]．應用化學，2005，22（10）：1122-1126．

[11]宋建彬，任孝修．以殼聚糖為載體固定化青霉素酰化酶的研究[J]．化工進展，2004，23（2）：181-183．

[12]周桓，張秋禹，金鳳．新型固定化酶載體的合成及其功能[J]．化工進展，2009，28（3）：462-467．

[13]郝曉敏，谷長生，宋文東，等．耐高溫α-淀粉酶酶解木薯淀粉研究[J]．糧食加工，2008，33（2）：40-42．

[14]Shogren R L，Willett J L，Atanu Biswas．HRP-mediated synthesis of starch-polyacrylamide graft copolymers[J]．Carbohydrate Polymers，2009，75：189-191．

[15]吳斌杰，孫建中，蔡智奇，等．膠囊固定化辣根過氧化物酶酶促體系引發丙烯酰胺聚合研究[J]．功能高分子學報，2004，17（3）：385-390．

[16]尚小琴，童張法，廖丹葵，等．反相乳液法淀粉丙烯酰胺接枝共聚反應的研究[J]．高校化學工程學報，2006，20（3）：460-463．

[17]黨亞固，費德君，唐建華．淀粉接枝丙烯酰胺絮凝劑的制備及性能研究[J]．四川大學學報，2002，34（5）：50-52．

[18]董延茂，路建美．淀粉接枝聚乙烯胺的合成與性能研究[J]．高校化學工程學報，2005，19（1）：65-68．

[19]Athawale V D，Lele V．Synthesis and characterization of graft copolymers of maize starch[J]．Carbohydrate Polymers，2000，41：407-416．

[20]高黨鴿，馬建中，呂斌，等．丙烯酸樹脂/二氧化硅復鞣劑的制備及應用研究[J]．中國皮革，2007，36（1）：11-14．

[21]汪秀麗，張玉榮，王玉忠. 淀粉基高分子的研究進展[J]．高分子學報，2011（1）：24-33．

[22]Durand A，Lalot T，Brigodiot M，et al．Enzyme-mediated initiation of acrylamide polymerization：Reaction mechanism[J]．Polymer，2000，41：8183-8192．

[23]Alain Durand，Thierry Lalot，Maryvonne Brigodiot，et al. Enzymemediated radical initiation of acrylamide polymerization：Main characteristics of molecular weight control [J]．Polymer，2001，42：5515-5521．

Synthesis and characterization of graft copolymer of degraded starch and acrylamide initiated by immobilized HRP/H2O2/ACAC catalyzed system

YAN Xiaoliang，Lü Shenghua，HOU Mingming，GONG Rui
（College of Resource and Environment，Shaanxi University of Science & Technology，Xi’an 710021，Shannxi，China）

Horseradish peroxidase（HRP）was immobilized on the surface of chitosanviaglutaraldehyde crosslinking. Then a graft copolymer of degraded starch and acrylamide was synthesized by the initiation of enzyme catalysis system composed of chitosan-immobilized HRP/H2O2/acetylacetone（ACAC）. The structure of the copolymer was analyzed by FTIR，UV，NMR and SEM. The results indicated that polyacrylamide（PAM）was successfully grafted onto the degraded starch. Then，the copolymer was applied as a retanning agent. The applied results showed that the retanned leather had the merits of softness，good dispersion of fiber and strong selecting filling properties.

immobilized HRP；enzymatic polymerization；graft copolymerization；tanning agent

TQ 316.342

A

1000–6613（2011）12–2708–06

2011-05-16；修改稿日期：2011-06-16。

國家自然科學基金（20876091）、陜西省自然科學基金（SJ08B06）及陜西科技大學研究生創新基金項目。

閆小亮（1985—），男，碩士研究生。聯系人：呂生華，教授，博士生導師，從事精細化學品研究。E-mail lsh630603@ yahoo.com.cn。