曲古抑菌素A對心衰大鼠心臟促炎細胞因子及心功能的影響*

郭艷琳， 張華屏， 郭建紅， 劉育艷， 秦達念， 王淑秋， 楊志明， 康玉明△

(山西醫科大學1 生理系，2 病理教研室，3 基礎醫學院，6 第二醫院心內科， 山西 太原 030001；4 汕頭大學醫學院生理教研室， 廣東 汕頭 515041；5 佳木斯大學病生教研室， 黑龍江 佳木斯 154007)

曲古抑菌素A對心衰大鼠心臟促炎細胞因子及心功能的影響*

郭艷琳1,2， 張華屏3， 郭建紅2， 劉育艷1， 秦達念4， 王淑秋5， 楊志明6， 康玉明1△

(山西醫科大學1生理系，2病理教研室，3基礎醫學院，6第二醫院心內科， 山西 太原 030001；4汕頭大學醫學院生理教研室， 廣東 汕頭 515041；5佳木斯大學病生教研室， 黑龍江 佳木斯 154007)

目的觀察組蛋白脫乙酰化酶抑制劑曲古抑菌素A(TSA)對心肌梗死后心衰(HF)大鼠心臟腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)及心功能的影響。方法采用冠狀動脈左前降支結扎術致心肌梗死制備大鼠HF模型和假手術模型(sham)，給予TSA或vehicle處理。給藥4周后，測定血流動力學參數，應用免疫組織化學和ELISA檢測左室心肌TNF-α、IL-1β和iNOS的水平，并測定右室/體重(RV/BW)、肺重/體重(LW/BW)。結果與HF+vehide組相比，給予TSA后可使HF大鼠心肌組織內增高的TNF-α、IL-1β和iNOS含量明顯降低(P<0.05)，左室舒張末壓(LVEDP)和LW/BW降低(P<0.05)；降低的左室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左室內壓最大下降速率(-dp/dtmax)明顯升高(P<0.05)。結論組蛋白脫乙酰化酶抑制劑TSA抑制心肌梗死后HF大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β及iNOS的產生，并且可能通過該抑制作用改善HF大鼠的心功能，減輕肺淤血。

組蛋白脫乙酰基酶抑制劑； 曲古抑菌素A； 心力衰竭； 腫瘤壞死因子； 白細胞介素 1； 一氧化氮合酶

慢性充血性心力衰竭是一種常見的、預后不良的心血管重癥，是多種心血管疾病的共同終末階段。在65歲以上老年人入院病例中，心力衰竭(heart failure,HF)是最常見的原因，而且隨著人口老齡化，這種情況會越來越嚴重[1]。關于HF發病機制以及相應治療方法的研究意義深遠。HF的發生涉及多系統、多環節，其中炎癥細胞因子在HF發生和惡性進展過程中發揮重要作用[2]。抗細胞因子治療成為心衰治療的一個新途徑。但是，到目前為止由于藥物安全性等問題，抗細胞因子治療尚未取得理想的效果[3]。尋找更為安全、有效的抗細胞因子藥物的工作仍很必要。組蛋白脫乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor, HDACi)可以通過調節組蛋白以及一些非組蛋白的乙酰化狀態，進而影響基因的表達[4,5]。由于HDACi可誘導細胞周期阻滯，誘導腫瘤細胞的分化和凋亡，而且重要的是對機體的副作用小，多年來被廣泛地用于各種惡性腫瘤的治療[4,5]。近年來，出現了諸多關于HDACi通過調控炎癥細胞因子表達而起到抗炎作用的研究[6,7]，但HDACi是否能影響HF時炎性細胞因子的表達，從而改善HF時心功能的惡化，這方面的研究國內外均很少報道。曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)是鏈霉菌屬的代謝產物，它是第1個被發現的能抑制組蛋白脫乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs)的天然氧肟酸鹽[5]。本研究將通過對心肌梗死后HF大鼠長期給予TSA，初步觀察TSA對HF大鼠心臟腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白細胞介素 1β(interleukin 1β, IL-1β)和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的表達及心功能的影響。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要試劑 TSA購自Sigma-Aldrich；兔抗TNF-α和iNOS抗體，北京博奧森公司產品；大鼠通用型IL-1β ELISA試劑盒，R&D產品(靈敏度5 ng/L)；總蛋白定量采用南京建成生物工程研究所總蛋白定量測試盒(考馬斯亮藍法)；免疫組化SP試劑盒為福州邁新公司產品；DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2動物 成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠48只，體重(250±30)g，山西醫科大學實驗動物中心提供。

2方法

2.1模型制備 隨機選取成年健康雄性SD大鼠28只用于HF模型的制備，20只假手術模型(sham)作對照。結扎左冠狀動脈前降支制備心力衰竭模型；假手術模型只穿線不結扎。術中監測標準Ⅱ導心電圖，出現ST段和/或T波抬高或降低，心臟局部顏色變白、室壁運動減弱等變化作為結扎成功的標志。術后即刻和術后12 h給予青霉素(3×104U)和丁丙諾啡(0.05 mg/kg)。待大鼠蘇醒后入籠飼養。

2.2動物分組及給藥 大鼠HF組和sham組術后第2 d給予曲古抑菌素A(DMSO稀釋，0.5 mg/kg，ip，2次/d)[8]或vehicle(VEH，DMSO 250 μL/kg，ip，2次/d)處理，持續4周。HF組術后24 h死亡5只，所以隨機分組如下：HF+TSA組(12只)、HF+VEH組(11只)、sham+TSA組(10只)和sham+VEH組(10只)。4周后HF+TSA組死亡2只，HF+VEH組死亡3只，因此4周后用于指標檢測的大鼠分組如下：HF+TSA組(10只)、HF+VEH組(8只)、sham+TSA組(10只)和sham+VEH組(10只)。每組大鼠隨機選取一半進行血流動力學測量評價心功能，而后處死動物，采集心臟組織，標本凍存留待檢測各項指標；一半進行心臟灌流用于免疫組織化學染色。

2.3血流動力學測定 大鼠在術后4周時戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，剪開頸部皮膚，分離頸部肌肉，暴露右側頸總動脈，插入自制的直徑約 0.5 mm的抗凝硬塑管至主動脈，硬塑管另一端連接成都泰盟生物機能實驗系統(BL-410S)觀察記錄動脈收縮壓、舒張壓和心率，然后進一步將導管深入到左心室內記錄左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)、左心室內壓最大上升速率(maximal rate of rise of left ventricular pressure, +dp/dtmax)和左心室內壓最大下降速率(maximal rate of decline of left ventricular pressure,-dp/dtmax)。

2.4解剖學測量 血流動力學測定結束后剪開胸壁暴露心臟，立即剪取心臟放入冷肝素生理鹽水中以沖洗血液，將心臟在濾紙上瀝干，用眼科剪去除大血管、心房和左室壁，取右心室(包括室間隔)稱重，與體重相除計算右室/體重比(right ventricular weight/body weight, RV/BW)。肺組織完整取下后用濾紙吸干表面血液并稱重，與體重相除計算肺重/體重比(lung weight/body weight, LW/BW)。

2.5免疫組織化學染色 大鼠戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，實施心臟灌流術(生理鹽水和2%多聚甲醛)，取完整心臟組織置于2%多聚甲醛中后固定5 h，然后轉移到由0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液配制的30%蔗糖溶液中浸泡2-3 d。固定好的心臟組織OCT包埋，然后進行冰凍切片，切片厚度10 μm。免疫組化染色采用高靈敏度的SP法。為了降低背景染色，切片首先用3% H2O2室溫、避光孵育10 min以消除內源性過氧化物酶，洗片后0.3% Triton X-100 37 ℃孵育30 min增加膜通透性利于抗原抗體結合，10%正常羊血清37 ℃孵育1 h以防與非特異抗體結合，傾去血清后分別加Ⅰ抗(兔抗TNF-α，1∶100；兔抗iNOS，1∶100)4 ℃過夜，而后按照SP試劑盒進行染色，DAB顯色，最后脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察、拍照。選取心肌組織非梗死區，用Image-Pro Plus 6.0彩色醫學圖像分析系統對目的蛋白的表達進行半定量分析(平均吸光度=圖像中陽性部位總吸光度/所測視野面積)，每張切片選取5個視野，取其均值。

2.6酶聯免疫吸附實驗(ELISA) 采用通用型大鼠IL-1β ELISA試劑盒(R&D，靈敏度5 ng/L)檢測大鼠心臟IL-1β的含量。檢測按照試劑盒說明書操作。心臟組織總蛋白定量采用南京建成生物工程研究所總蛋白定量測試盒(考馬斯亮藍法)。

3統計學處理

結 果

1各組大鼠血流動力學及解剖學指標測定結果

HF組(HF+VEH和HF+TSA)大鼠與sham組(sham+VEH和sham+TSA)大鼠相比，LVEDP、RV/BW和LW/BW明顯增加(P<0.05)，+dp/dtmax和-dp/dtmax明顯降低(P<0.05)。HF給藥組(HF+TSA)與HF空白對照組(HF+VEH)相比，LVEDP和LW/BW降低(P<0.05)，+dp/dtmax和-dp/dtmax增加(P<0.05)，但RV/BW無顯著差異,見表1。

表1 術后4周各組大鼠血流動力學及解剖學指標比較

*P<0.05vscontrol (sham+TSA or sham+VEH);#P<0.05vsHF + VEH. VEH: vehicle; TSA: trichostatin A; HF: heart failure.

2各組大鼠心肌組織TNF-α表達比較

免疫組織化學染色顯示：TNF-α蛋白陽性呈棕黃色顆粒，位于胞漿內，主要在心肌細胞內表達。模型組(HF+VEH組或HF+TSA組)與sham組(sham+VEH組或sham+TSA組)相比，TNF-α陽性表達的范圍及強度均增加(P<0.05)；模型給藥組(HF+TSA組)與模型對照組(HF+VEH組)相比，TNF-α陽性表達的范圍及強度均有所降低(P<0.05),見圖1。

3各組大鼠心肌組織IL-1β含量比較

ELISA結果顯示：模型組(HF+VEH組或HF+TSA組)與sham組(sham+VEH組或sham+TSA組)相比，心臟IL-1β含量明顯增加(P<0.05)；模型給藥組(HF+TSA)與模型對照組(HF+VEH)相比，心臟IL-1β含量下降(P<0.05)，見圖2。

4各組大鼠心肌組織iNOS的表達比較

免疫組織化學染色顯示：iNOS蛋白陽性呈棕黃色顆粒，主要在心肌細胞胞漿內表達。模型組(HF+VEH組或HF+TSA組)與sham組(sham+VEH組或sham+TSA組)相比，iNOS的表達量增加(P<0.05)；模型給藥組(HF+TSA組)與模型對照組(HF+VEH組)相比iNOS表達量有所降低(P<0.05),見圖3。

討 論

慢性充血性HF是高血壓、冠心病、風濕性心臟病、擴張性心肌病、先天性心臟病等多種心血管疾病的共同終末階段。在所有的病因中，冠心病是引起HF最主要的原因。而且，隨著人們生活水平的提高，冠心病的發病率在逐年升高，因此本研究采用冠狀動脈結扎制作HF模型，能夠理想地模擬臨床冠心病-心肌梗死-心力衰竭的病理過程，具有實際意義。

近年來，炎癥細胞因子在心衰發生發展過程中的作用越來越受到重視。循環中炎癥細胞因子水平與心衰嚴重程度密切相關，并常作為心衰預后的指標[2]。心臟局部的炎癥細胞因子可通過介導心室重構、降低心肌收縮力、使β-腎上腺素受體失偶聯等作用促進HF的發生進展[2]。其中，TNF-α和IL-1β是最為重要、與HF不斷進展關系最為密切的細胞因子[2]。TSA是鏈霉菌屬的代謝產物，是一種HDACi,在多種疾病的動物模型中，其抗炎作用得到證明[8,9]，能夠降低多種炎癥細胞因子的水平。本研究顯示，HF大鼠心肌組織炎癥細胞因子TNF-α和IL-1β含量增加，這與多數報道一致；慢性給予TSA后可使兩者水平下降，提示TSA可對心肌梗死后心肌組織TNF-α和IL-1β的產生起抑制作用。本研究還發現：慢性給予TSA后可使HF大鼠增加的LVEDP降低，降低的+dp/dtmax和-dp/dtmax增加，左室收縮與舒張功能明顯改善。正常心臟TNF-α和IL-1β不表達或表達量極少，而心肌梗死后心肌組織缺氧、血流動力學改變、室壁張力增加及神經內分泌異常均可促使心肌組織合成TNF-α和IL-1β。TNF-α和IL-1β具有很強的負性肌力作用，兩者表達增加后，可以通過多種途徑導致心功能的損傷[2]。因此，二者表達增加和慢性心力衰竭互相影響形成惡性循環，加重心功能惡化、促進肺水腫形成。本研究中慢性給與TSA后可使心肌梗死后HF大鼠心肌組織TNF-α和IL-1β的產生下降，對惡性循環的發生可以起到有效的緩解作用，因此給藥組大鼠心肌梗死后心功能的下降明顯減輕。左室功能的改善有利于肺淤血減輕，因此LW/BW有所降低。肺淤血減輕可以減緩右室的肥大，但本研究中RV/BW的降低沒有統計學意義。具體的原因可能與HF程度、肺淤血程度以及樣本量的大小等因素有關，我們將進行進一步的實驗。

圖1免疫組化顯示心臟TNF-α的表達

圖2各組大鼠心臟IL-1β含量測定結果比較

圖3免疫組化顯示心臟iNOS的表達

心肌局部NO的水平與心肌收縮力密切相關。體內NO是在NOS家族作用下產生的。體內有3型NOS：神經型一氧化氮合酶(nNOS)、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)。在心肌組織主要是iNOS起作用。本實驗結果顯示，大鼠心肌梗死4周后心肌組織iNOS表達增多，這與多數報道一致。iNOS表達增加可使心臟局部NO水平升高，高水平的NO對心肌組織具有強大的負性肌力和細胞毒等效應，最終導致心功能的損傷[10]。慢性給與TSA后可使心肌梗死后HF組大鼠心肌組織iNOS的表達下降，提示TSA對心肌梗死后心肌組織iNOS的產生起抑制作用。心肌梗死后多種炎性細胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平增加，而這些炎性細胞因子均可激活心肌組織iNOS的表達[11]。TSA除調節組蛋白的乙酰化外，也調節包括轉錄因子如NF-κB的乙酰化狀態[4,5]。NF-κB作為促炎癥基因表達的樞紐之一，不但可誘導細胞因子的表達，也可誘導iNOS的表達[4]。Chabane等[12]研究發現TSA可以抑制TNF-α和IL-1β誘導的iNOS的表達(蛋白和mRNA水平)。因此本研究給予TSA后對心肌梗死后心肌組織iNOS表達的抑制作用可能存在至少兩種可能：一種是通過降低心肌組織炎癥細胞因子如TNF-α和IL-1β，繼而引起iNOS的表達降低；另一種是通過改變NF-κB的乙酰化狀態直接抑制iNOS的表達。具體的機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究顯示，作為HDACi,TSA可能對心肌梗死后心肌組織TNF-α、IL-1β及iNOS的增加起抑制作用，并且通過該抑制作用對心功能改善及肺淤血減輕發揮作用。值得提出來的是，HDACi具有抗炎作用，可以抑制多種炎癥細胞因子的表達，但某些情況下，它對炎癥細胞因子的表達卻起促進作用[13,14]。出現這種情況的原因在于，不同的HDACs具有不同的乙酰化模式，調節不同的基因；不同的HDACs也可能具有不同的被調節方式；加之調節特定非組蛋白脫乙酰化的特定HDAC還不清楚，因此，應用非選擇性的HDACi來處理細胞或動物常常導致蛋白表達和細胞功能似是而非、相互矛盾的改變[5]。由于這方面的研究尚處于探索階段，實驗過程中還可能存在某些未知混雜因素的作用，因此，本研究的結果有待進一步驗證。

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EffectsoftrichostatinAonexpressionofproinflammatorycytokinesinheartsandcardiacfunctioninratswithheartfailure

GUO Yan-lin1, 2, ZHANG Hua-ping3, GUO Jian-hong2, LIU Yu-yan1, QIN Da-nian4, WANG Shu-qiu5, YANG Zhi-ming6, KANG Yu-ming1

(1DepartmentofPhysiology，2DepartmentofPathology，3InstituteofPreclinicalMedicine，6InstituteofCardiology,TheSecondHospital,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;4DepartmentofPhysiology,ShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041,China;5DepartmentofPathophysiology,JiamusiUniversity,Jiamusi154007,China.E-mail:yumingkang66@163.com)

AIM: To observe the effects of histone deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA) on the expression of tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin 1β (IL-1β) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) in hearts and cardiac function in rats with heart failure(HF).METHODSSprague-Dawley rats were subjected to coronary artery ligation to induce HF, or sham surgery (sham). Subsequently, the animals were treated with TSA or vehicle (VEH) for 4 weeks. After 4 weeks, the haemodynamic, the anatomical parameters and the levels of TNF-α, IL-1β and iNOS in hearts were measured.RESULTSAfter treated with TSA, the levels of TNF-α, IL-1β and iNOS in hearts and left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP), lung weight/body weight (LW/BW) were reduced (P<0.05),while +dp/dtmaxand -dp/dtmaxwere increased in heart failure rats (P<0.05).CONCLUSIONThese findings indicate that histone deacetylase inhibitor TSA may improve cardiac function and attenuate pulmonary congestion in rats with HF via inhibiting TNF-α, IL-1β and iNOS production in hearts.

Histone deacetylase inhibitors; Trichostatin A; Heart failure; Tumor necrosis factor; Interleukin 1; Nitric oxide synthase

R363

A

1000-4718(2011)03-0425-05

2010-09-16

2010-11-01

國家自然科學基金資助項目(No. 30770867)；教育部留學回國人員科研啟動基金資助項目；國家教育部博士點基金資助項目(No. 20070114002)；山西省自然科學基金資助項目(No. 2010011052-1)

△通訊作者 Tel：0351-4135520; E-mail: yumingkang66@163.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.002