大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Rho激酶對(duì)p-Smad1核遷移的作用及機(jī)制*

李春香， 李福海， 夏 偉△， 時(shí) 慶， 汪大琨

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院1兒科，2低溫醫(yī)學(xué)研究室，山東 濟(jì)南250012)

大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Rho激酶對(duì)p-Smad1核遷移的作用及機(jī)制*

李春香1， 李福海1， 夏 偉1△， 時(shí) 慶2， 汪大琨2

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院1兒科，2低溫醫(yī)學(xué)研究室，山東 濟(jì)南250012)

目的研究Rho激酶對(duì)p-Smad1核遷移的作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，探討它們?cè)诜窝苤貥?gòu)中的作用機(jī)制。方法分離培養(yǎng)大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，應(yīng)用血小板源性生長(zhǎng)因子BB(PDGF-BB)啟動(dòng)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Rho激酶信號(hào)通路，應(yīng)用骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)啟動(dòng)BMP信號(hào)通路，并用Rho激酶抑制劑Y-27632、MEK抑制劑U0126進(jìn)行干預(yù)。培養(yǎng)細(xì)胞分成5組：(1)對(duì)照組；(2)BMP-2組；(3)BMP-2+PDGF-BB組；(4)BMP-2+PDGF-BB+Y-27632組；(5)BMP-2+PDGF-BB+U0126組。免疫熒光染色標(biāo)記p-Smad1在細(xì)胞核內(nèi)外的分布并計(jì)算p-Smad1核遷移陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(即核遷移率)。分離平滑肌細(xì)胞核蛋白和胞漿蛋白，Western blotting分析p-Smad1在細(xì)胞內(nèi)的總量和細(xì)胞核內(nèi)外相對(duì)含量的變化。Kit-WST-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖。結(jié)果BMP-2組p-Smad1在細(xì)胞內(nèi)的總量、在細(xì)胞核中的相對(duì)含量和核遷移率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；BMP-2+PDGF-BB 組p-Smad1的核遷移率和在細(xì)胞核中的相對(duì)含量明顯低于BMP-2組(P<0.05)，但是細(xì)胞內(nèi)p-Smad1總量無(wú)明顯改變(P>0.05)；BMP-2+PDGF-BB+ Y-27632組和BMP-2+PDGF-BB+U0126組細(xì)胞內(nèi)p-Smad1的總量、在細(xì)胞核中的相對(duì)含量和核遷移率與BMP-2組基本相似(P>0.05)。BMP-2組的A值明顯小于對(duì)照組(P<0.05)；PDGF-BB+BMP-2組的A值明顯大于BMP-2組(P<0.05)且大于對(duì)照組(P<0.05)；BMP-2+PDGF-BB+Y-27632組和BMP-2+PDGF-BB+U0126組的A值均小于PDGF-BB+BMP-2組(P<0.05)。結(jié)論在大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，PDGF-BB激活的Rho激酶通過MEK/ERK1/2抑制BMP-2引起的p-Smad1核遷移，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖。

肺動(dòng)脈; 平滑肌細(xì)胞；Rho激酶；骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)2；p-Smad1核遷移

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary artery hypertension,PAH) 的發(fā)生，先是肺微小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生及表型的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致血管壁增厚、內(nèi)徑狹小、張力增高[1]，而后不但引起肺血管收縮性改變，而且導(dǎo)致肺小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)重構(gòu)。文獻(xiàn)資料表明Rho激酶信號(hào)通路和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信號(hào)通路在PAH肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)過程中發(fā)揮了相反的調(diào)節(jié)作用。促有絲分裂因子(PDGF、5-羥色胺、血管緊張素Ⅱ等)通過激活RhoA/Rho激酶/MEK/ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)肺血管中膜平滑肌細(xì)胞的增生和肥大[2,3]，而骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2(bone morphogenetic protein receptor2,BMPR 2)基因突變和表達(dá)降低是原發(fā)性PAH和各種繼發(fā)性PAH的重要發(fā)生機(jī)制[4-6]。MAPK (MEK/ERK1/2)可以磷酸化BMP下游信號(hào)分子p-Smads(1 /5 /8)的中間鏈接區(qū)，抑制其向細(xì)胞核內(nèi)的遷移，從而抑制BMP信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。本研究假定這2條通路之間存在相互作用，通過體外培養(yǎng)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，分別應(yīng)用BMP-2和血小板源性生長(zhǎng)因子BB(platelet-derived growth factorBB,PDGF-BB)啟動(dòng)BMP信號(hào)通路和激活Rho激酶，并用Rho激酶抑制劑Y-27632和MEK抑制劑U0126進(jìn)行干預(yù)，免疫熒光染色觀察p-Smad1在細(xì)胞核內(nèi)外的分布；提取分離胞漿和胞核蛋白，Western blotting檢測(cè)p-Smad1在細(xì)胞內(nèi)的總量和細(xì)胞核內(nèi)外的分布；旨在揭示Rho激酶對(duì)p-Smads核遷移的作用及機(jī)制，探討它們?cè)赑AH肺血管重構(gòu)中的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)

Wistar大鼠(約180 g)，開胸取心肺，用顯微剪及顯微鑷在放大鏡下循肺動(dòng)脈主干逐級(jí)追入肺實(shí)質(zhì)，取肺動(dòng)脈2級(jí)及以下分支，冷PBS液中剝除外膜纖維脂肪層，縱向剪開血管，內(nèi)面朝上彎頭小鑷子自上而下刮除內(nèi)膜，留中膜平滑肌層。分次酶消化法收集細(xì)胞(0.25%胰酶)。加入含10%FBS-LDMEM(Gibco)的培養(yǎng)基，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，3-5 d后換培養(yǎng)基。采用平滑肌α-actin單克隆抗體(Santa Cruz)對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定[8]。

2免疫熒光標(biāo)記p-Smad1在細(xì)胞核內(nèi)外的分布

2.1分離培養(yǎng)原代大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 傳代培養(yǎng)至3-5代時(shí)備用。

2.2肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Rho激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的干預(yù) 肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞種植到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，10%FBS-LDMEM中培養(yǎng)至70%-80%融合，然后在含1% FBS基質(zhì)中靜止24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)周期同步到G0期，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分為5組，在再次加入10%FBS-LDMEM啟動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，不同分組細(xì)胞分別加入相應(yīng)試劑孵育：(1)對(duì)照組：加入10%FBS-LDMEM孵育;(2)BMP-2組：在10%FBS-LDMEM孵育30 min后，再加入2 μg/L BMP-2 (Peprotech);(3)BMP-2+PDGF-BB組： 在10%FBS-LDMEM中孵育15 min，然后加入10 μg/L PDGF-BB孵育15 min，最后加入2 μg/L BMP-2;(4)BMP-2+PDGF-BB+Y-27632組：在10%FBS-DMEM中孵育的同時(shí)加入10 μmol/L Y-27632孵育15 min，然后加入10 μg/L PDGF-BB孵育15 min，最后加入2 μg/L BMP-2;(5)BMP-2+PDGF-BB+U0126組： 在10%FBS-DMEM中孵育的同時(shí)加入10 μmol/L U0126孵育15 min，然后加入10 μg/L PDGF-BB孵育15 min，最后加入2 μg/L BMP-2。每組的不同干預(yù)點(diǎn)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2.3肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞p-Smad1細(xì)胞核內(nèi)外分布量檢測(cè) 加入上述試劑后，在10%FBS-DMEM 中繼續(xù)孵育5 min至24 h，每隔5-60 min收取細(xì)胞做免疫熒光染色p- Smad1(5-60 min內(nèi)間隔5 min，1-6 h間隔20 min，6-12 h間隔40 min， 12-24 h間隔60 min)。染色方法為：多聚甲醛固定細(xì)胞，含0.1% Triton X-100 PBS緩沖液中透化處理，羊抗p-Smad1抗體(Santa Cruz)孵育、羅丹明標(biāo)記兔抗山羊Ⅱ抗(中杉金橋公司)染色，倒置相差熒光顯微鏡觀察p-Smad1在細(xì)胞核內(nèi)外的分布。4，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI,Roche分裝)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行對(duì)比染色。實(shí)驗(yàn)先后重復(fù)了4次。每組在不同時(shí)點(diǎn)的3個(gè)復(fù)孔中隨機(jī)取10個(gè)視野拍照。將4次實(shí)驗(yàn)的拍照結(jié)果進(jìn)行匯總，每組隨機(jī)取10張免疫熒光照片(n=10)，觀察分析p-Smad1在細(xì)胞核內(nèi)外的分布，計(jì)算p-Smad1核遷移陽(yáng)性的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，即核遷移率。同一細(xì)胞，p-Smad1在細(xì)胞核中濃聚，即在細(xì)胞核中分布明顯濃于細(xì)胞質(zhì)，就視為p-Smad1核遷移陽(yáng)性，見圖1。

Figure 1. The cell p-Smad 1 nuclear translocation (immunofluorescent staining,×200).

圖1p-Smad1核遷移陽(yáng)性的細(xì)胞

3Westernblotting檢測(cè)p-Smad1在細(xì)胞核內(nèi)外的分布

細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至4-5代，在含1% FBS基質(zhì)中靜止24 h，在再次加入10%FBS-LDMEM啟動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)進(jìn)行分組并加入相應(yīng)試劑孵育(同免疫熒光)。 在加入所有試劑孵育1h后，每組取至少2瓶細(xì)胞，分離核蛋白和細(xì)胞漿蛋白，操作參照核蛋白提取試劑盒(Bestbio)。Western blotting簡(jiǎn)要步驟是：加蛋白提取物進(jìn)行12%SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)到NC膜、封閉、滴加Ⅰ抗。所用Ⅰ抗為鼠抗β-actin(1∶1 000，中杉金橋公司)抗體和羊抗p-Smad1(1∶500，Santa Cruz)抗體。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠Ⅱ抗孵育(1∶20 000，中杉金橋公司)及兔抗山羊Ⅱ抗孵育(1∶20 000，中杉金橋公司)。免疫反應(yīng)條帶用電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL,Millipore)，然后直接對(duì)印記膜進(jìn)行熒光CCD掃描。用Quantity One軟件進(jìn)行輝度分析。以β-actin作內(nèi)參照，目的蛋白色條帶輝度與β-actin顯色條帶輝度比值代表目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。5組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)4次。

4CellCountingKit(CCK)-WST-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖

接種細(xì)胞懸液于96孔板中，100μL/well，在培養(yǎng)箱內(nèi)穩(wěn)定過夜。第2 d對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組并每隔2 h加入相應(yīng)試劑孵育(分組情況及加試劑濃度同免疫熒光)，連續(xù)24 h。做細(xì)胞數(shù)目測(cè)定時(shí)每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度(A值)，測(cè)定的A值與增殖細(xì)胞數(shù)量呈線性關(guān)系。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1細(xì)胞鑒定

大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞免疫熒光結(jié)果可見，細(xì)胞質(zhì)α-actin均勻發(fā)紅色熒光、細(xì)胞核發(fā)藍(lán)色熒光，細(xì)胞純度平均達(dá)98%以上,見圖2。

Figure 2. Morphology and purity of rat pulmonary artery smooth muscle cells(immunofluorescent staining,×200).

圖2大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的鑒定

2免疫熒光標(biāo)記p-Smad1在細(xì)胞核內(nèi)外的分布

免疫熒光染色顯示，對(duì)照組p-Smad1在大部分細(xì)胞漿中(95%以上)顯色很弱并分布均勻，而且隨著時(shí)間延長(zhǎng)變化不大，30 min后在少數(shù)細(xì)胞核內(nèi)有較弱的濃聚，核遷移率僅占10.00%±0.71%。BMP-2組，在5 min后p-Smad1在細(xì)胞核內(nèi)的濃聚即開始，30 min到高峰期，最大核遷移率達(dá)到68.00%±1.05%，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01)，且這種高峰期可持續(xù)2 h，濃聚現(xiàn)象雖逐漸衰退，但24 h后仍可存在，且p-Smad1在細(xì)胞核內(nèi)濃聚的細(xì)胞數(shù)目24 h內(nèi)始終大于20%。BMP-2+PDGF-BB組，5 min后p-Smad1在細(xì)胞核內(nèi)的濃聚也開始，但與BMP-2組比較，沒有明顯高峰期出現(xiàn)，p-Smad1的最大核遷移率為29.40%±2.52%，與BMP-2 組相比差異顯著(P<0.01)，大部分細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中的p-Smad1分布均勻如對(duì)照組。BMP-2+PDGF-BB+Y-27632組和BMP-2+PDGF-BB+U0126組，在5min后p-Smad1在細(xì)胞核中的濃聚亦開始，30 min達(dá)到高峰期，p-Smad1的最大核遷移率分別為64.20%±1.43%和65.80%±1.83%，與BMP-2+PDGF-BB組相比差異顯著(P<0.05)，濃聚表現(xiàn)類似BMP-2組(P>0.05)，只是高峰期持續(xù)時(shí)間略短,見圖3-5。

Figure 3. Distribution of p-Smad1 in pulmonary artery smoth muscle cells 1 h after BMP-2 exposure(immunofluorescent staining,×200). A:control group;B: BMP-2 group;C:BMP-2+PDGF-BB group;D: BMP-2+PDGF-BB+ Y-27632 group; E:BMP-2+ PDGF-BB+ U0126 group.

圖3免疫熒光標(biāo)記p-Smad1在細(xì)胞核內(nèi)外的分布

圖4免疫熒光標(biāo)記p-Smad1核遷移陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)

圖5細(xì)胞核內(nèi)p-Smad1核遷移隨時(shí)間變化趨勢(shì)

3Westernblotting結(jié)果

據(jù)免疫熒光的結(jié)果，選擇p- Smad1在細(xì)胞核中濃聚達(dá)到高峰期(BMP-2作用1 h)時(shí)進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。與對(duì)照組相比，BMP-2組p-Smad1在細(xì)胞漿的總量以及在細(xì)胞核的相對(duì)含量明顯增多(P<0.05)；BMP-2+PDGF-BB 組p-Smad1在細(xì)胞核的相對(duì)含量明顯低于BMP-2組(P<0.05)，細(xì)胞內(nèi)p-Smad1總量有減少趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異(P>0.05)；BMP-2+PDGF-BB+ Y-27632組和BMP-2+PDGF-BB+U0126組p-Smad1的總量以及在細(xì)胞核中的相對(duì)含量與BMP-2組基本相似(P>0.05)，其細(xì)胞核內(nèi)相對(duì)含量明顯高于BMP-2+PDGF-BB組(P<0.05)，見圖6、7。

4CCK-WST-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果

加試劑作用12 h，BMP-2組A值(1.924±0.086)明顯小于對(duì)照組A值(2.032±0.176)(P<0.05)，說(shuō)明BMP-2明顯抑制了細(xì)胞增殖；PDGF-BB+BMP-2組A值(2.456±0.045)顯著大于BMP-2組(P<0.05),且A值亦大于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明PDGF-BB阻斷了BMP-2對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用而且促進(jìn)了細(xì)胞的增殖；BMP-2+PDGF-BB+Y-27632組A值(2.312±0.079)和BMP-2+PDGF-BB+U0126組A值(2.204±0.207)均小于PDGF-BB+BMP-2組(P<0.05)，說(shuō)明Y-27632和U0126抑制了PDGF-BB的促細(xì)胞增殖作用,見圖8。

Figure 6. Western blotting analysis of p-Smad1 1 h after BMP-2 exposure. A: control group;B: BMP-2 group;C:BMP-2+PDGF-BB group;D:BMP-2+PDGF-BB+ Y-27632 group; E:BMP-2+ PDGF-BB+ U0126 group.

圖6BMP-2作用1h細(xì)胞漿及細(xì)胞核內(nèi)p-Smad1相對(duì)含量

圖7BMP-2作用1h細(xì)胞核中p-Smad1的相對(duì)表達(dá)量

圖8BMP-2作用12h各組細(xì)胞的增殖情況

討 論

綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加入BMP-2后：免疫熒光顯示p-Smad1往細(xì)胞核中遷移明顯增多，Western blotting也顯示p-Smad1在細(xì)胞核中的含量較對(duì)照組明顯增多，而CCK-WST-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果顯示BMP-2明顯抑制細(xì)胞的增殖；再加入PDGF-BB后p-Smad1往細(xì)胞核中遷移被明顯抑制，在細(xì)胞核中的含量也明顯減少，細(xì)胞增殖結(jié)果顯示細(xì)胞增殖明顯；再加入Y-27632和U0126后p-Smad1又恢復(fù)了往細(xì)胞核中遷移，p-Smad1在細(xì)胞核中的含量也顯著增加，細(xì)胞增殖結(jié)果顯示細(xì)胞增殖的趨勢(shì)被抑制。以上的結(jié)果充分說(shuō)明，在大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，PDGF-BB激活的Rho激酶通過MEK/ERK1/2抑制BMP-2引起的p-Smad1核遷移來(lái)促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖。

BMPs屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族，能夠調(diào)節(jié)多種生物過程。在心血管生理方面，BMPs對(duì)血管平滑肌細(xì)胞主要發(fā)揮促進(jìn)分化和凋亡、抑制增生作用，以維持血管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。Smads是BMP信號(hào)通路的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，BMPs與其受體結(jié)合后，磷酸化其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad1/5/8的受體活化區(qū)(C末端)，磷酸化的Smads(p-Smads)遷移到細(xì)胞核內(nèi)，

調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。在該研究中，分離培養(yǎng)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，加入10%FBS-LDMEM啟動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，加入BMP-2后，免疫熒光染色觀察到明顯的p-Smad1核遷移，在細(xì)胞核中濃聚的細(xì)胞達(dá)到70%，Western blotting的檢測(cè)結(jié)果亦表明細(xì)胞內(nèi)總量和細(xì)胞核內(nèi)p-Smad1顯著增多，提示BMP-2成功啟動(dòng)了BMP信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。Kit-WST-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果證實(shí)BMP-2確實(shí)抑制了細(xì)胞的增殖。

PDGF是一種作用很強(qiáng)的促有絲分裂因子，在各種原因所致的肺動(dòng)脈高壓肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)過程中，表達(dá)增強(qiáng)的PDGF對(duì)肺動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞發(fā)揮了很強(qiáng)的促分裂、促增生作用[9，10]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，PDGF-BB能夠有效抑制p-Smad1的核遷移，在加入PDGF-BB后，免疫熒光和Western blotting結(jié)果均顯示細(xì)胞核內(nèi)p-Smad1明顯減少，而加入Y-27632抑制Rho激酶活性或U0126 (MEK抑制劑)抑制ERK1/2激活后，p-Smad1的核遷移得到很大程度的恢復(fù)，阻斷了PDGF-BB對(duì)BMP-2啟動(dòng)的p-Smad1核遷移的抑制作用，表明PDGF-BB通過激活RhoA/Rho激酶/MEK/ERK1/2信號(hào)通路抑制了p-Smad1核遷移。在該研究中雖然PDGF-BB能夠有效抑制p-Smad1的核遷移，而細(xì)胞內(nèi)的p-Smad1總量卻沒有減少，提示PDGF-BB并非通過干擾p-Smad1 C末端的磷酸化抑制其核遷移，應(yīng)該是通過激活RhoA/Rho激酶MEK/ERK1/2信號(hào)通路磷酸化p-Smads的中間連接區(qū)，致p-Smads被Smurf1降解[11]，抑制p-Smads的核遷移， p-Smads被Smurf1降解量，相對(duì)于細(xì)胞核內(nèi)的含量，發(fā)生顯著改變，而相對(duì)于細(xì)胞漿和細(xì)胞內(nèi)總量，影響甚微，所以p-Smad1總量雖有減少趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異。細(xì)胞增殖結(jié)果充分顯示PDGF-BB阻斷了BMP-2對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，而加入Y-27632抑制Rho激酶活性或U0126 (MEK抑制劑)抑制ERK1/2后，PDGF-BB的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用又被抑制。所以，PDGF-BB通過抑制p-Smad1的核遷移阻斷BMP信號(hào)通路對(duì)平滑肌細(xì)胞的穩(wěn)定作用進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，這有可能是RhoA/Rho激酶信號(hào)通路促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制之一，見圖9。

Figure 9. The cross talk of Rho kinase signaling pathway and BMP signaling pathway. Rho kinase and BMP-2 cross talking at p-Smad1 by phosphorylating its link region and C-terminal, respectively.

圖9Rho激酶信號(hào)通路和BMP信號(hào)通路的相互作用，它們分別磷酸化p-Smad1連接區(qū)和羧基末端

[1] Barbera JA,Peinado VI,Santos S.Pulmonary hypertension in chronic obstructive puImonary disease[J].Eur Respir J,2003,21(5):892-905.

[2] Nossaman BD,Kadowitz PJ.The role of the RhoA/rho-kinase pathway in pulmonary hypertension[J].Curr Drug Discov Technol,2009，6(1):59-71.

[3] Chen XY,Dun JN,Miao QF,et al.Fasudil hydrochloride hydrate,a Rho-kinase inhibitor, suppresses 5-hydroxytryptamine-induced pulmonary artery smooth muscle cell proliferation via JNK and ERK1/2 pathway[J].Pharmacology,2009,83(2):67-79.

[4] Takahashi H,Goto N,Kojima Y,et al.Downregulation of type II bone morphogenetic protein receptor in hypoxic pulmonary hypertension[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2006，290(3):L450-L458.

[5] Ramos MF,Lamé MW,Segall HJ,et al.Smad signaling in the rat model of monocrotaline pulmonary hypertension[J].Toxicol Pathol,2008，36(2):311-320.

[6] Rondelet B,Kerbaul F,van Beneden R,et al.Signaling molecules in overcirculation-induced pulmonary hypertension in piglets:effects of sildenafil therapy[J]. Circulation,2004,110(15):2220-2225.

[7] Kretzschmar M,Doody J,Massagué J.Opposing BMP and EGF signalling pathways converge on the TGF-β family mediator Smad1[J].Nature, 1997,389(6651):618-622.

[8] 洪 城,王 健,李 冰,等.大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分離與原代培養(yǎng)[J].中華生物醫(yī)學(xué)工程雜志,2007,13 (3):176-179.

[9] Szewczyk NJ,Peterson BK,Jacobson LA.Activation of Ras and the mito protein kinase pathway promotes protein degradation in muscle cells ofCaenorhabditiselegans[J].Mol Cell Biol,2002,22(12):4181-4188.

[10]Chang F,Steelman LS,McCubrey JA.Raf-induced cell cycle progression in human TF-1 hematopoietic cells[J].Cell Cycle,2002,1(3):220-226.

[11]Sieber C,Kopf J,Hiepen C,et al.Recent advances in BMP receptor signaling[J].Cytokine Growth Factor Rev,2009,20(5-6):343-355.

EffectsofRhokinaseonp-Smad1nucleartranslocationinratpulmonaryarterysmoothmusclecells

LI Chun-xiang1, LI Fu-hai1, XIA Wei1, SHI Qing2, WANG Da-kun2

(1DepartmentofPediatrics,2CryomedicineLaboratory,QiluHospitalofShandongUniversity,Jinan250012,China.E-mail:cicql@163.com)

AIM: To explore the mechanism of bone morphogenetic protein (BMP) and Rho kinase signal pathways on the proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells.METHODSPulmonary smooth muscle cells were isolated from the rat distal pulmonary artery and cultured. BMP and Rho kinase pathways were activated by BMP-2 and platelet-derived growth factor BB(PDGF-BB)，respectively. Rho kinase inhibitor Y-27632 and MEK inhibitor U0126 were also used. Immunofluorescent staining was applied to observe p-Smad1 distribution across the nucleus, and the cells with positive p-Smad1 nuclear accumulation were counted and the nuclear translocation rate was calculated. The total p-Smad1 and its distribution across the nucleus were quantitatively determined by Western blotting. The cell proliferation was analyzed by CCK-8 assay.RESULTSExposure to BMP-2 significantly increased both the total amount of p-Smad1 and its nuclear accumulation in pulmonary smooth muscle cells. Pretreatment with PDGF-BB significantly decreased the nuclear accumulation of p-Smad1 induced by BMP-2 without decrease of total p-Smad1. However, pretreatment with Y-27632 or U0126 reversed the inhibitory effect of PDGF-BB on p-Smad1 nuclear accumulation. BMP-2 significantly inhibited the cell proliferation, but PDGF-BB blocked the effect of BMP-2 and significantly increased the cell proliferation. After pretreated with Y-27632 or U0126, the PDGF-BB-activated cell proliferation was suppressed.CONCLUSIONPDGF-BB-activated Rho kinase inhibits BMP-2-induced p-Smad1 nuclear translocation via MEK/ERK1/2, and increases pulmonary artery smooth muscle cell proliferation.

Pulmonary artery; Smooth muscle cells; Rho kinase; Bone morphogenetic protein-2; p-Smad1 nuclear translocation

R363

A

1000-4718(2011)03-0443-07

2010-09-26

2011-01-12

山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金資助項(xiàng)目(No.2008BS03017)

△通訊作者 Tel:0531-82169940;E-mail:cicql@163.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.005